oA基因的⑶S序列。沉 积物中总基因 DNA以1~IOng的水平作为模板加入每个反应混合物中。按照表2配制PCR 反应体系。
[0122] 表2 PCR反应体系配方
[0123]
[0124] 用无菌CldH2O代替DNA作为阴性对照。操作过程均在冰浴中进行。采用 LightCycler480 Software 1. 5. 0软件对实验数据进行分析。
[0125] RT-PCR 反应条件：
[0127] 其中，PCR反应体系的配制在本发明原态微生物油气与水合物勘探工作站（isMOST Station 1)中完成。操作流程如下：
[0128] SI.按照表2配制好的反应体系混合液（除了 2 μ L DNA模板），分装于2ml灭菌 离心管中，每管大于0. 5ml，置于制冷保存的载物架中。
[0129] S2.将原态微生物油气与水合物勘探工作站（isMOST Station 2)提取和纯化的 带核酸样品的深孔板一起置于载物架中，作为DNA模板。
[0130] S3.执行原态微生物油气与水合物勘探工作站（isMOST Station 1)设定的程序， 将建立PCR反应体系所需的混合试剂和2 μ L DNA模板依次加入对应的、新的深孔板中，即 完成PCR反应体系的配置。
[0131] 后续步骤参照文献（邵明瑞等，2013,三种油气指示菌定量PCR方法的建立及其 在油气田土壤中的初步应用，生物技术通报，第4期，172-178)进行操作，实验结束后，用 LightCycler 480 Software 1.5. 0软件对实验结果进行分析，即可获得样品中甲烧氧化菌 的丰度。
[0132] 实施例4本发明自动化工作站工作性能测试
[0133] 1.样品处理能力
[0134] 从本发明检测系统运行记录总结出，处理96个海洋沉积物平行样的起始时间是 11点06分26秒，终止时间是12点46分03秒，约耗时1小时40分（即100分钟）；本发明 检测系统按每天运行8小时，则每天可处理样品数=(8小时X60分/小时）X96个/100 分]= 461个；每年运行时间按300天计，则本发明检测系统每年可处理样品13. 83万个。
[0135] 2.提取核酸的效果
[0136] 从上述获得的96个核酸样品中任意选取9个样品进行PCR扩增，其电泳图如图4 所示。为了进行核酸提取效果的对比，将手工处理陆地土壤样品中细菌的电泳图展示于图 5中。对比图4和图5可以明显看出：
[0137] (1)用本发明检测系统提取的核酸质量很高，且非常稳定及具有可重复性（见图4 中的1至9灰白色条带）；
[0138] (2)本发明检测系统核酸纯化得非常好（图4中灰白色条带的亮度基本一致），这 与图5中明显不同（图5a :核酸没有提取出来；图5b :核酸虽然提取出来，但具有从很亮至 逐渐变暗的带状变异趋势，反映出核酸纯化得不好）；
[0139] (3)从样品中扩增出的细菌条带与M条带（标志物Marker)之间的距离可以看出， 用手工提取的细菌核酸，其分子量大致在2万左右（图5);而用本发明检测系统提取的细 菌核酸，其分子量大致在20万左右（图5)，反映出用本发明检测系统提取核酸不容易水解， 这为后续对细菌的丰度进行荧光定量提供了更佳的样品，会使定量精度更高、更准确。
[0140] (4)本发明检测系统同时能提供试验过程的真实记录，使所获得的数据不仅具有 可追溯性，且因其具有相同误差，故能对数据进行统一的误差校正。
[0141] 3.同一样品的对比实验
[0142] 按照本发明方法以及采用现有常规的手工提取的方法提取同一个海洋沉积物样 品所得提取核酸效果的比较结果列于表3 :
[0143] 表 3
[0144]
[0145] *海水之下沉积物的深度。
[0146] 从上表3看出：（1)用本发明方法提取核酸的效率明显比手工提取的效率高，平均 高出约14% ; (2)用本发明方法提取核酸的稳定性（误差约为0. 3% )明显比手工提取核 酸的稳定性（误差约为7. 6% )好。
【主权项】
1. 一种甲烷氧化菌丰度的自动化检测方法，其特征在于，包括以下步骤：51. 构建原态微生物油气与水合物勘探技术的自动化工作站；所述工作站包括自动液 体处理装置、核酸提取设备、PCR反应体系配置系统；52. 样品处理，每个样品得到大于I. 5 ml的上清液；53. 采用本发明原态微生物油气与水合物勘探工作站自动液体处理装置完成移液；具 体是执行自动液体处理装置设定的程序，将不同的试剂通过自动控制机械臂上移液通道和 移液模块的动作自动加入对应的样品板、结合板、洗涤板和洗脱板中；54. 自动核酸提取设备提取与纯化DNA，将所有的样品板都准备好后，执行本发明原态 微生物油气与水合物勘探工作站设定程序，得到土壤和/或沉积物中的总基因组DNA ;核酸 提取与纯化流程结束后经自动液体处理装置将样品的核酸提取液移转移至微量PCR管中， 标记清楚后于-20 °C冰箱中保存；55. 琼脂糖电泳检测；56. 经实时荧光定量PCR检测，获得甲烷氧化菌丰度。2. 根据权利要求1所述甲烷氧化菌丰度的自动化处理方法，其特征在于，S5步骤所述 琼脂糖电泳检测操作方法如下： (1) 取5 W DNA提取液于1%琼脂糖上电泳鉴定，DNA Ladder为DL2000 ; (2) 若有> 2 kbp条带，则取5 W DNA提取液加灭菌水稀释20倍后作为PCR模板并在 4°C下保存，样品基因组DNA提取液保存于-20 °C。3. 根据权利要求1所述甲烷氧化菌丰度的自动化检测方法，其特征在于，S6步骤所述 甲烷氧化菌丰度的荧光定量PCR检测包括以下步骤： (1) 甲烷氧化菌的培养； (2) 设计特异性引物； (3) 制备标准品； (4) 建立实时荧光定量PCR的反应体系和反应条件； 其中，PCR反应体系的配制在本发明原态微生物油气与水合物勘探工作站中完成； 操作流程如下：561. 按照配制好反应体系混合液，经自动液体处理装置分装于灭菌离心管中，每管大 于0.5 ml，置于制冷保存的载物架中；562. 将原态微生物油气与水合物勘探工作站提取与纯化的带核酸样品的深孔板一起 置于载物架中，作为DNA模板；563. 执行原态微生物油气与水合物勘探工作站设定的程序，将建立PCR反应体系所需 的混合试剂和DNA模板依次加入对应的、新的深孔板中，即完成PCR反应体系的配置； (5) 对样品进行实时荧光定量PCR检测，分析实验结果，即可获得样品中甲烷氧化菌的 丰度。4. 根据权利要求3所述甲烷氧化菌丰度的自动化检测方法，其特征在于，步骤（2)所述 引物序列为： F: 5' -CTGGCAGGGCATTCAGGATT-3' ； S: 5'-GAAGAAGGGCGTCAGCGTGT-3'。
【专利摘要】本发明公开了一种甲烷氧化菌丰度的自动化检测方法。包括构建原态微生物油气与水合物勘探技术的自动化工作站、样品处理、采用工作站自动液体处理装置完成移液、自动核酸提取设备提取与纯化DNA、琼脂糖电泳检测、甲烷氧化菌丰度的实时荧光定量PCR检测、获得其丰度结果等步骤。本发明基于自动分析方法，使甲烷氧化菌的核酸提取与纯化步骤实现自动化；使其特异基因PCR反应体系的配制实现自动化，减少手工操作引入的人为因素所造成的误差，操作步骤在洁净环境中运行，整个检测过程通过计算机软件控制，检测流程可以追溯，可实现系统误差的统一校正。
【IPC分类】C12Q1/06, C12Q1/68
【公开号】CN105018609
【申请号】CN201510400780
【发明人】王江海, 徐贵新, 安合义, 徐小明, 郑新宁, 徐小燕
【申请人】广州安能特化学科技有限公司
【公开日】2015年11月4日
【申请日】2015年7月9日