042]下游引物：5' -CTAGTGCTCGAGAAGTC-3'（SEQIDNO. 10)。
[0043]PCR扩增条件为：94°C预变性 5min;94°C变性 50s，59°C退火 50s，68°C延伸 2min， 32个循环；68°C后延伸5min;25°C保温10min。将扩增产物与PMD19-TVector连接，转化 E.coliJM109感受态细胞，筛选获得阳性重组子，然后测序获得1436bp的序列，如SEQID NO. 3所示，即UPDPG焦磷酸酶基因的cDNA序列。
[0044] (2)以步骤1合成的cDNA第一条链为模板，以带有酶切位点的引物进行PCR扩增，
[0045]上游引物：5' -CATATGTCCTCCGAGATGGCAA-3'(SEQIDN0. 11);
[0046]下游引物：5'-CTCGAGCTAGTGCTCGAGAAGTC-3'（SEQIDN0. 12)。
[0047]PCR扩增条件为：94°C预变性 5min;94°C变性 50s，59°C退火 50s，68°C延伸 2min， 32个循环；68°C后延伸5min;25°C保温10min。将扩增产物连接PMD19-TVector，然后转 化E.coliJM109感受态细胞，筛选获得阳性重组子，经扩大培养后取菌液提取质粒，将提取 的质粒用NdeI和Xhol双酶切后回收1. 5k左右的目的片段，然后与NdeI和Xhol酶切后 的pet28a(+)载体连接，转化E.coliJM109感受态细胞，筛选获得阳性重组子，经扩大培养 后取菌液提取质粒，获得UDPG焦磷酸酶重组表达载体，命名为PET28a-UGPPase重组表达载 体。
[0048] 实施例3UDPG焦磷酸酶的表达与纯化
[0049] 将实施例2构建的重组表达载体PET28a_UGPPase转入E.coliBL21 (DE3)中，重组 菌在37°C和180rpm的条件下，培养至0D600nm约为0. 6,加入0. 1.mmol/L的IPTG进行诱 导，继续培养6h后，收集菌体，将菌体重新悬浮于20mMTris-HCl(pH7. 0)的缓冲液中，利用 超声破碎法裂解菌体，离心分离得到细胞上清；将细胞上清液通过Ni-NTA亲和层析法（亲 和层析柱为Qiagen公司Ni-NTAAgarose，catnumber30210)，用150mM的咪唑水溶液洗脱， 得到纯化蛋白。然后用SDS-PAGE检测蛋白，结果如图1所示。由图1可知，在泳道6上约 58kDa处出现单一条带，大小符合UDPG焦磷酸酶预测分子量57. 5Kda外加0. 6KDa的His标 签的分子量，表明带有His标签的UDPG焦磷酸酶成功重组表达和纯化。
[0050] 实施例4UDPG焦磷酸酶酶学性质
[0051] 采用UDPG焦磷酸酶水解底物UDPG生成1-磷酸葡萄糖和UMP，再通过加入1-磷 酸葡萄糖变位酶和6-磷酸葡萄糖脱氢酶和NAD，最终在340nm检测吸光度值的变化来反 应NAD的减少量，从而计算UDPG焦磷酸酶的活性。酶活力单位定义为在40°C，pH6. 0的 Tris-HCl缓冲液中，每分钟催化1ymolUDPG所需酶量为一个酶活单位U。然后检测UDPG 焦磷酸酶的酶活，反应体系为：l〇〇mMTris-HCl缓冲液（pH6. 0)，0. 8mMUDPG，5mMMgCl2， 0.8mMNAD，4U1-磷酸葡萄糖变位酶和4U6-磷酸葡萄糖脱氢酶及5ylUDPG焦磷酸酶，催 化温度40°C，反应时间30min，反应结束后加入3M三氯乙酸溶液终止反应。然后于0D34Qnm 检测吸光度的变化量，结果计算UDPG焦磷酸酶的酶活单位约为10U/y1。
[0052] 测定酶的最适反应温度：按照与上述相同的反应体系，测定反应温度分别为 20 °C、25 °C、30 °C、35 °C、40 °C、45 °C、50 °C条件下相对酶活力，其检测结果如图2所示。由图2 可知，UDPG焦磷酸酶的最适反应温度为40°C(将此处催化活性设定为100% )，在20-40°C条件下，相对酶活力较高，达到70% -100%，说明UDPG焦磷酸酶对温度的耐受力比较强。
[0053] 测定酶的最适反应pH:按照与上述相同的反应体系，区别在于分别使用pH为5、6、 7、8和9的Tris-HCl缓冲液检测相对酶活力，其检测结果如图3所示。由图3可知，UDPG焦磷酸酶的最适反应pH为6. 0 (将此处催化活性设定为100% )，当pH值高于7或低于5 时UDPG焦磷酸酶的相对活性快速下降，表明UDPG焦磷酸酶的适应pH范围较窄。
[0054] 测定酶的最适UDPG底物浓度：由于高浓度UDPG对反应存在抑制作用，测定不同 UDPG底物浓度下的UDPG焦磷酸酶的相对活力。按照与上述相同的反应体系，区别在于分别 选取UDPG浓度为0? 05mM、0.lmM、0. 2mM、0. 3mM、0. 4mM、0. 5mM时测定酶活力，结果如图4所 示。由图4可知，UDPG浓度为0. 2mM时，UDPG焦磷酸酶反应速度最大，随着UDPG浓度逐渐 增大，UDPG焦磷酸酶的催化活性急剧下降，当UDPG浓度为0. 5mM时，UDPG焦磷酸酶催化活 性基本受到抑制。
[0055] 测定底物特异性：反应体系中分别以5mMUDPG(尿苷二磷酸葡萄糖），5mM UDPGal(尿苷二磷酸半乳糖）、5mMUDPF(尿苷二磷酸果糖），5mMUDPRh(尿苷二磷酸鼠李 糖），5mMUDPGluc(尿苷二磷酸葡萄糖酸）为底物。在最适反应温度40°C和最适pH值6. 0 下，测定焦磷酸酶相对酶活力，结果如图5所示。由图5可知，UDPG焦磷酸酶对供体底物选 择性比较专一，只能催化UDPG和UDPGluc;其中UDPG为最适底物，对UDPGluc的催化活性 稍低，不能催化UDPGal(尿苷二磷酸半乳糖）、UDPF(尿苷二磷酸果糖），UDPRh(尿苷二磷酸 鼠李糖）。因此，UDPG焦磷酸酶可以用于专一催化合成UDP-葡萄糖和UDP-葡萄糖酸的合 成反应。
[0056] 实施例5出芽短梗霉中过表达UDPG焦磷酸酶
[0057]根据UDPG焦磷酸酶cDNA序列设计构建表达载体的引物，具体引物如下：
[0058]上游引物：5' -CCGCTCGAGATGGAAAAGCAACGCA-3'(SEQIDN0. 13);
[0059]下游引物：5' -ATAAGAATGCGGCCGCTCAGAGTTCCAATATC-3'(SEQIDN0. 14)。
[0060] 然后以出芽短梗霉cDNA为模板，SEQIDNO. 13和SEQIDNO. 14所示的核苷酸序 列为引物进行PCR扩增，PCR扩增条件为，94°C预变性51min;94°C变性50s，60°C退火50s， 72°C延伸2min，30个循环；25°C保温lOmin;扩增产物通过SalI和NotI酶切连入经同 样酶切的PAPE16载体的多克隆位点（见图6中），获得重组质粒pAPE16-UGPPase，如图7 所示。质粒pAPE16-UGPPase中目的基因上游装有短梗霉强启动子TEF1，下游装有终止子 TEFTT，筛选标记为潮霉素抗性基因。重组质粒pAPE16-UGPPase使用引物M13F-47(SEQID NO. 15)和M13R-48(SEQIDNO. 16)经PCR验证，琼脂糖电泳图结果如图8所示，泳道1为 DNAmarker，泳道2-7为PCR扩增的6个平行样，可以看到所有平行样都能扩增出5. 5k的目 的片段，这与预测结果大小一致，证明构建成功。使用引物NS2(SEQIDN0. 17)和NS7(SEQ IDNO. 18)，以质粒pAPE16-UGPPase为模板，采用PCR的方法获得带有潮霉素抗性基因和 UDPGase双表达盒的DNA片段，然后通过电击法使用线性片段转化原始菌出芽短梗霉NRRL 12974,通过潮霉素抗性平板筛选，获得在基因组上携带有外源UDPGase拷贝和潮霉素抗性 基因拷贝的重组工程菌。然后将重组工程菌进行发酵培养120小时，同时以原始菌为对照， 然后提取胞外多糖，并计算普鲁兰和0-1，3葡聚糖的各自的产量（发酵方法和多糖提取方 法见中国专利CN1696302A)。结果显示（见图9)，原始菌普鲁兰为28. 5g/L，而工程菌的普 鲁兰产量为35. 6g/L。原始菌0 -1，3葡聚糖的产量为1. 2g/L，而工程菌的葡聚糖产量为 2. 3g/L。表明UDPG焦磷酸酶的过表达能够增强出芽短梗霉细胞内的UDPG代谢流，能够提 高出芽短梗霉的胞外普鲁兰多糖和0 -1，3葡聚糖的含量。
[0061]M13F-47 :5' -CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3'（SEQIDN0. 15)
[0062]M13R-48 :5' -AGCGGATAACAATTTCACACAGGA-3'（SEQIDNO. 16)
[0063]NS2 引物：5' -CTCAAAGATTAAGCCATGCATGT-3'（SEQIDNO. 17)
[0064]NS7 引物：5' -TTCACCTACGGAAACCTTGT-3'（SEQIDNO. 18)
[0065] 最后说明的是上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上 述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式 上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。
【主权项】
1. 一种出芽短梗霉UDPG焦磷酸酶，其特征在于所述酶的氨基酸序列为SEQ ID NO. 1所 不。2. -种权利要求1所述出芽短梗霉UDPG焦磷酸酶编码基因，其特征在于所述编码基因 的核苷酸序列为SEQ ID NO. 2所示。3. -种由权利要求2所述出芽短梗霉UDPG焦磷酸酶编码基因构建的重组载体。4. 一种权利要求1所述出芽短梗霉UDPG焦磷酸酶在提高出芽短梗霉胞外多糖产量中 的应用。5. 如权利要求4所述的应用，其特征在于所述胞外多糖为普鲁兰多糖和0 -1，3葡聚 糖。6. 如权利要求4所述的应用，其特征在于所述的应用是将出芽短梗霉UDPG焦磷酸酶编 码基因转化入出芽短梗霉中，从而提高出芽短梗霉胞外多糖产量。7. 如权利要求6所述的应用，其特征在于所述出芽短梗霉为出芽短梗霉NRRL 12974。
【专利摘要】本发明公开了一种出芽短梗霉UDPG焦磷酸酶、编码基因、载体及在提高出芽短梗霉胞外多糖产量中的应用，所述酶的氨基酸序列为SEQ？ID？NO.1所示；本发明利用基因工程技术在出芽短梗霉原始菌中过表达UDPG焦磷酸酶，重组短梗霉普鲁兰多糖的产量能够提高32％，β-1,3葡聚糖产量能够提高55％；从分子角度证明UDPG焦磷酸酶参与两种胞外多糖的合成，为利用代谢工程技术改造出芽短梗霉的胞外多糖合成途径提供技术基础和方法指导。
【IPC分类】C12P19/08, C12P19/10, C12N15/80, C12N15/55, C12R1/645, C12N9/14
【公开号】CN105039281
【申请号】CN201510357839
【发明人】李海峰, 黄黎锋, 蓝袁洋, 高允允
【申请人】杭州师范大学
【公开日】2015年11月11日
【申请日】2015年6月25日