或者pTT5-SH5-CCDC8得到 的等体积的病毒上清，感染Hela-TZMbl指示细胞系检测病毒的感染性。Hela-TZMbl细胞 在HIV-1 LTR启动子下游带有荧光素梅（Luciferase)报告基因，可以指示病毒的感染性。 G 是将共转染 HIV-1 BH10 和 pTT5-SH5-EGFP 或者 pTT5-SH5-CCDC8 得到的等量的 2ng p24 的病毒上清，感染Hela-TZMbl指示细胞系，得到的感染性实验结果。
[0019] 图4是(XDC8可以和HIV-1 Gag相互作用蛋白印迹检测图，其中，A在HEK293T细 胞中分别转染vGag-RRE加Rev，HIV-l BH10 P-，和BH10,得到病毒样和病毒颗粒。使用蛋 白印迹实验检测内源性(XDC8的结果。B是将HIV-1 BH10 P-病毒经过或者没有经过蛋白 酶Subtilisin处理，将处理和没有处理的病毒用蛋白印迹实验检测结果。C上图为示意图， 将野生型Gag(WT)缺失基质蛋白区8-126位的氨基酸。下图为野生型和缺失8-126位氨基 酸的Gag转染HEK293T细胞，蛋白印迹实验检测内源性(XDC8的结果。D是共转染HIV-1 BH10 P-和pTT5-SH5-EGFP或者pTT5-SH5-CCDC8,48小时后，将细胞匀浆，低速离心得到上 清S1。将S1进行超速离心得到上清S100和沉淀P100。蛋白印迹实验检测S1、S100、P100 和P100/S100比例。E是细胞膜漂浮实验，将P100使用蔗糖密度梯度离心，因为细胞膜较 轻，会漂浮起来。离心后，从上到下分别等体积取组分1、2、3、4、5、6、7、8、9，蛋白印迹实验检 测Gag和细胞膜标志物Carveolin和转铁蛋白受体TFR。
[0020] 图5是(XDC8可以引起HIV-1 Gag的内化共聚焦显微镜图，其中，A是绿色荧光 蛋白 GFP 标记的 Gag--vGag-GFP (绿色）和 mCherry 标记的 CO)C8--mCherry_C8 (红 色）共转染J1EK293T细胞，24小时后，用DAPI染色，共聚焦显微镜观察的结果。B同A，仅把 CCDC8换成了空载体。C是共转染vGag-GFP和pTT5-SH5-CCDC8或者空载体，不同时间点将 细胞固定，DAPI染色，共聚焦显微镜观察。D是定量分析，计数50-100个细胞，计算带有内 化Gag点的细胞比例。作图，横轴是时间，纵轴是带有内化Gag点的细胞比例。E是将质粒 vGag-GFP和空载体或者pTT5-SH5-CCDC8,或者Dynamin K44A共转染，转染后16小时定量 分析。黑色条代表带有内化点的Gag或在细胞膜上的Gag比例，白色条代表细胞浆中弥散 的Gag，误差棒代表重复3次的结果。
[0021] 图6是HIV-1 Gag可以和CCDC8、0BSL1和Cul7相互作用的蛋白印迹检测图，其中， A是蛋白印迹分析0BSL1和Cul7的抗病毒作用。B是蛋白印迹分析免疫共沉淀实验Gag、 0BSL1和(XDC8的相互作用的结果，其中0BSL1带有V5标签，（XDC8带有Flag标签。C是 蛋白印迹分析免疫共沉淀实验6 &8、(》511、〇：008和(：1117的相互作用的结果，其中(》511带 有V5标签，Cul7带有Flag标签，CCDC8带有His标签。PS341是蛋白酶体抑制剂。
[0022] 图7是(XDC8可以引起HIV-1 Gag的多泛素化和降解的蛋白印迹检测图，其中，A 是在HEK293T细胞中，转染vGag-RRE，Rev, HA-Ub，HA-Ub-KOR，蛋白印迹实验检测细胞裂解 物的结果。其中HA标记泛素Ub和突变体Ub-KOR。B是蛋白印迹实验检测免疫共沉淀的实 验结果，使用抗Gag抗体沉淀，抗HA检测。C是用同位素 35S标记蛋氨酸和胱氨酸，使用免疫 共沉淀实验，不同时间点检测Gag的降解情况。D是C的结果重复3次的如果，作图。E是 (XDC8作用机制模式图，即HIV-l Gag到细胞膜上组装，遇到(XDC8后，改变了途径，内化、多 泛素化，最终降解。
[0023]图8是将(XDC8 C截短后仍然具有抗病毒活性的蛋白印迹检测图，其中，A是将 CCDC8截短示意图，标记的数字为氨基酸的位置，没有将前面的His标签计算在内。B是蛋 白印迹实验检测几种截短体的抗病毒活性。
【具体实施方式】
[0024] 实施例1、CCDC8的HIV-1抗性实验
[0025] 首先，构建表达CCDC8的质粒pTT5-SH5-CCDC8。载体pTT5-SH5为蒙特利尔生物技 术研究所（Yves Durocher，Biotechnology Research Institute, Montreal, Canada)构建 并提供载体序列。使用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR)的方法，引物为TT-(XDC8-BamHI和 TT-(XDC8-EcoRI (如表1)，扩增(XDC8,将扩增后的产物用限制性内切酶BamHI和EcoRI酶 切后，克隆入PTT5-SH5载体里。CCDC8序列由Invitrogen公司测定确认（SEQ ID No.l)， 蛋白序列根据三联密码子规则翻译而来SEQ ID N〇2)。
[0026] 然后，在含有5 %二氧化碳的3 7 °C培养箱中，使用带有10 %血清和青链霉素的 DMEM培养基培养HEK293T细胞（CRL-11268，ATCC)。细胞复苏后，培养两周，待稳定后，可以 使用。将J1EK293T细胞分在100mm培养皿中培养，细胞数2. 5 X 106/培养皿。细胞培养24小 时后，使用Lipofectamine2000(Invitrogen)转染试剂，共同转染质粒pTT5-SH5-CCDC8和 HIV-1 BH10(可以产生HIV-1病毒），转染质粒的量按图中所标注的，即恒定的2yg HIV-1 BH10质粒和分别0、1、2、4 y g的pTT5-SH5-CCDC8。因实验涉及HIV-1病毒，故实验应该在 生物安全实验室中进行。培养48小时后，收集上清及细胞。上清液中含有HIV-1病毒，将 上清液置于20%蔗糖溶液上，使用Beckman超速离心机，SW41转头35000RPM，离心1小时。 沉淀中含有HIV-1病毒。将上清液沉淀和细胞，使用带有蛋白酶抑制剂的细胞裂解液将其 裂解。通过蛋白印迹实验（常规实验，实验步骤略去），检测病毒P24。检测结果如图3。质 粒PTT5-SH5-CXDC8在细胞中表达，可以强烈抑制HIV-1的产量（如图3)。
[0027] CCDC8与HIV-1的作用方式
[0028] 下面我们试图回答(XDC8如何与HIV-1相互作用的。我们使用(XDC8抗体检测病 毒内的CCDC8(如图4A)。在HIV-1全病毒颗粒（BH10)，病毒样颗粒（vGag)和蛋白酶阴性的 病毒里都可以检测到内源性的CCDC8(图4A)。下面的问题，CCDC8到底是和HIV-1的那一 部分结合？是HIV-1的Gag，还是病毒的包膜Env Gpl20。我们把病毒用蛋白酶Subtilisin 处理14小时，处理后的病毒经过蛋白印迹实验检测，处理后的病毒带有Gag，但是包膜蛋白 Gpl20已经消失（图4B)，即Gpl20和外面的蛋白已经被降解掉，结果依然可以检测到内源 性(XDC8。这一结果表明（XDC8可以和Gag结合，而不是病毒包膜Gpl20或其它的细胞膜。 下一步，我们进一步确定(XDC8和Gag的那一部分结合。我们把HIV-1 Gag进行了基因缺 失，使用PCR的方法，去除了 MA区A 8-126位，结果发现缺失A 8-126位的病毒，已经检测 不到内源性的(XDC8。这些结果表明，(XDC8可以和HIV-1 Gag的基质蛋白（MA)区结合。
[0029] (XDC8作用在HIV-1病毒的组装步骤
[0030] 下面我们试图回答CCDC8到底作用在病毒复制的哪一个步骤。因为上述实验结果 已经表明(XDC8并没有抑制病毒Gag的表达，也就是作用在蛋白翻译后的某一步。在HIV-1 的复制周期中，病毒Gag蛋白合成后，首先到细胞膜上进行组装，然后出芽释放。下面我们 分离细胞膜，先将病毒蛋白酶阴性的HIV-1 (HIV-1 P-)和阴性对照EGFP或者CCDC8共同表 达，48小时后收获细胞，放置于带有蛋白酶抑制剂（罗氏公司产）的缓冲液Tris-EDTA(TE) bufTer(20mM Tris-HCl ph7.4，lmM EDTA，0.01% 疏基乙醇）中，将细胞研碎，低速 1500g离心30分钟，去除细胞残片，收取上清（S1)。再将上清S1进行高速离心100, 000g 离心1小时，得到上清S100和沉淀P100。细胞膜主要在P100里（图4D)。将P100重悬于 200 y 1 TNE缓冲液中（20mM Tris-HCl ph 7. 5, lOOmM NaCl, ImM EDTA),与 lml 85. 5%的蔗 糖TNE溶液混合放置于管底，上面放有2. 5ml 65%蔗糖和1. 5ml 10%蔗糖。使用Beckman 离心机，4°C 35000RPM离心16小时。由于细胞膜较轻，可以漂浮起来，通过蔗糖密度梯度离 心，分离出不同组分，从上到下，依次为组分1、2、3、4、5、6、7、8、9(图4E)。通过细胞膜漂浮 实验，就可以分离出细胞膜（图4E)。其中Carveolin和转铁蛋白受体（TFR)是已知的细胞 膜蛋白，作为细胞膜的标志。我们发现，细胞膜主要在上层组分2和组分3。我们发现，有 无(XDC8，HIV-1 Gag的分布并没有明显变化。也就是说，(XDC8并没有抑制HIV-1 Gag和细 胞膜的结合，并没有抑制Gag的细胞膜组装。同时，我们也发现(XDC8的分布与Carveolin 和转铁蛋白受体（TFR)在一个组分中，提示CCDC8可能是膜蛋白。
[0031] (XDC8定位在细胞膜上，可以引起HIV-1 Gag的内化
[0032] 下面，我们使用共聚焦荧光显微镜观察标记有mCherry的(XDC8(红色）的蛋白 (图5A)。将HEK293T细胞转染mCherry-CCDC8和Gag-GFP (绿色），24小时后，细胞固定观 察，发现(XDC8主要定位在细胞膜上，而GFP标记的HIV-1 Gag也在细胞膜上进行组装（图 5A)。CCDC8的膜定位与上述细胞膜漂浮实验CCDC8与膜蛋白Carveolin和转铁蛋白受体 TFR在一个组分结果吻合。我们也发现，当（XDC8表达时，HIV-1 Gag-GFP的分布出现了变 化，Gag-GFP细胞内绿色颗粒明显增多（图5A，5B)。每一个绿色GFP颗粒代表一个Gag分 子，当Gag没有聚合或仅是少量聚合时，绿色呈弥散分布。当Gag聚合成病毒颗粒时，形成 Gag的多聚物，绿色呈强信号。接下来，