菌。
[0020]主要试剂:Taq DNA聚合酶、DNA marker购自Takara公司；引物由南京金斯瑞生物技术有限公司合成；蛋白酶K购自Roche公司；Bst DNA聚合酶大片段购自NEB公司；SYBR GreenI 购自 Invitrogen 公司。
[0021]I真菌菌丝的收集
取保存的菌株接种于PDA平板上，25°C下生长3d，挑新鲜菌丝，接种于装有I / 3体积PDB的250mL三角瓶中。25°C 120 r/min，培养3_4d，至生成大量菌丝团为止。双层纱布过滤，蒸馏水连续冲洗，滤纸吸干水分，置于1.5mL离心管-20°C保存备用。
[0022]2真菌DNA的提取
采用改进的CTAB法提取真菌菌丝DNA，具体步骤如下:
(O取适量的菌丝(约0.5g)于研钵中，加液氮快速磨成粉末(至少加液氮研磨3次)；
(2)将样品粉末用灭菌的药匙转移到1.5mL的离心管中，加700 yL在65°C水浴锅中预热的CTAB提取缓冲液，然后将离心管放在65°C的恒温水浴中保持45min，每隔1min轻轻的颠倒几次，使粉末和缓冲液混合均匀；
(3)12000rpm，4°C离心 lOmin，吸取上清液；
(4)加入700μ L抽提液I (苯酚:氯仿:异戊醇=25:24:1)，轻轻颠倒数次至溶液混匀；
(5)12000rpm，4°C离心 lOmin，吸取上清液；
(6)加入700μ L抽提液I，轻轻颠倒数次至溶液混匀；
(7)12000rpm，4°C离心 lOmin，吸取上清液；
(8)加入600μ L抽提液II (氯仿:异戊醇=24:1)，反复混匀；
(9)12000rpm，4°C离心 lOmin，吸取上清液；
(10)加入600μ L预冷的异丙醇，轻轻摇匀，放在冰上30min ；
(11)弃上清，并加入600μ L 70%的乙醇洗涤沉淀两次；
(12)置于无菌操作台上，吹干(约20min)；
(13)加入20-200 μ LddH2O,溶解 DNA ；
(14)使用分光光度计检测DNA浓度，并将浓度调整为约10ng/μ L，_20°C保存备用。
[0023]3.假禾谷孢囊线虫LAMP引物设计
根据假禾谷镰刀菌EFl-α序列，设计并筛选下述LAMP引物(图1)，其中包括两条外引物(F3和B3)，两条内引物(FIP和BIP)，FIP由Flc-F2组成，BIP由Blc_B2组成，Flc和Blc分别是Fl和BI的互补序列。引物由南京金斯瑞生物技术有限公司合成。序列如下: 外引物 FpF3 5’ TCCCACAAATCATTCCCTGG 3’
外引物 FpB3 5’ AACATACCAATGACGGTGACA 3’
内引物 FpFIP 5’ AGGAACCCTTACCGAGCTCGGGCGCATCATCACGTGTCA3’
内引物 FpBIP 5’ CAAGCTCAAAGCCGAGCGTGAAGGAGTCTCGAACTTCCAGA3’
4.LAMP反应体系配制:外引物FpB3和FpF3各0.2ymol/L，内引物FpFIP和FpBIP各 1.6 μ mol/L ； 1mmol/L dNTP，20mmol/L Tris-HCl(pH8.8), 10 mmol/LKCl, 5 mmol /LMgSO4, 10 mmol/L (NH4)2SO4, 0.l%Trinton x-100, 0.lmol/L甜菜碱，8U Bst DNA聚合酶大片段。
[0024]I μ I模板DNA ;加灭菌双蒸馏水补全到25 μ I。
[0025]5.LAMP反应体系扩增条件:将以上反应成分加入离心管混合后，置于60~65°C恒温水浴中 3(T90min，82°C保温 lOmin。
[0026]6.LAMP结果检测:结果可以采用以下两种检测方法:
I)将上述反应完的体系中加入2 μ I的显色剂，轻晃混匀，即可肉眼观察。
[0027]2 )取2 μ I扩增产物在2%琼脂糖凝胶电泳中电泳观察梯形条带。
[0028]检测结果:阳性结果，具有绿色荧光；阴性对照，为深褐色。
【主权项】
1.一种假禾谷镰刀菌LAMP的检测引物，其特征在于:所述检测引物的序列如下:外引物 FpF3 5’ TCCCACAAATCATTCCCTGG 3’外引物 FpB3 5’ AACATACCAATGACGGTGACA 3’内引物 FpFIP 5’ AGGAACCCTTACCGAGCTCGGGCGCATCATCACGTGTCA3’内引物 FpBIP 5’ CAAGCTCAAAGCCGAGCGTGAAGGAGTCTCGAACTTCCAGA3’。2.利用权利要求1所述的假禾谷镰刀菌LAMP的检测引物进行LAMP反应的反应体系，其特征在于，25 μ I反应体系中: 引物混合液:0.2 ymol/L外引物FpB3、0.2 ymol/L外引物FpF3，1.6 ymol/L内引物FpFIP、1.6 μ mol/L 内引物 FpBIP ；反应混合液:10mmol/L dNTP、20mmol/L Tris-HCl (ρΗ8.8)、10 mmol/LKCl、5 mmol/LMgSO4UO mmol/L (NH4)2SO4^0.1% Trinton x_100、0.1 mol/L 甜菜碱、8U Bst DNA 聚合酶大片段； I μ I模板DNA，加灭菌双蒸馏水补全到25 μ I。3.如权利要求2所述的假禾谷镰刀菌LAMP的反应体系的检测方法，其特征在于:将引物混合液和反应混合液混匀后加入I μ I模板DNA，加灭菌双蒸馏水补全到25 μ I，61飞6°C保温3(T90min，82°C保温lOmin，得到的产物中加入有显色剂，轻甩离心管观察，所述显色剂为SYBR Green I与PCR级DMSO的混合物，SYBR Green I与PCR级DMSO的体积比为1:9。4.如权利要求3所述的假禾谷镰刀菌LAMP的检测方法在诊断植物的假禾谷镰刀菌感染情况或鉴别假禾谷镰刀菌中的应用。
【专利摘要】本发明公开了一种假禾谷镰刀菌LAMP的检测引物，所述检测引物的序列如下：外引物FpF3？？5ˊ？TCCCACAAATCATTCCCTGG？3ˊ；外引物FpB3？？5ˊ？AACATACCAATGACGGTGACA？3ˊ；内引物FpFIP？5ˊ？AGGAACCCTTACCGAGCTCGGGCGCATCATCACGTGTCA3ˊ；内引物FpBIP？5ˊ？CAAGCTCAAAGCCGAGCGTGAAGGAGTCTCGAACTTCCAGA3ˊ。本发明所提供的假禾谷镰刀菌LAMP检测方法特异性强，所用的特异引物根据假禾谷镰刀菌的EF1-α区域设计出4条引物，特异性比常规PCR要强。检测时间短，1h左右即可获得检测结果，比常规PCR节省2-4h。仪器设备要求低，不需要普通PCR所需的PCR仪、凝胶电泳成像系统，只需要一个水浴锅即可完成检测。
【IPC分类】C12R1/77, C12Q1/04, C12N15/11, C12Q1/68
【公开号】CN105039504
【申请号】CN201510176701
【发明人】施艳, 李洪连, 王振跃, 史亚娟, 陈琳琳, 孙炳剑
【申请人】河南农业大学
【公开日】2015年11月11日
【申请日】2015年4月15日