NO:3);
内引物 BIP:CGGGGGATCCACTAGTTCTAGTTTTGAATTCGAGCTCGGTAC (SEQ ID NO:4);环引物 LB:GCCGCGTTAACTGCAGGT (SEQ ID NO:5)；
(2)Bst DNA聚合酶:浓度为8 U/ μ L，分装100 μ L放入一个新的1.5 mL离心管中；
(3)10X反应缓冲液:包含200 mmol/L Tris-HCUpH 8.8，100 mmol/L KCl, 100 mmol/L (NH4)2SO4,80 mmol/L MgSOjPI 8 mol/L 甜菜碱，分装 250 μ L 放入一个新的 1.5 mL 离心管中；
(4)dNTPs溶液，由浓度分别为10 mmol/L的dATP、dCTP、dGTP, dTTP四种脱氧核糖核苷酸溶液等体积混合而成，分装500 μ L放入一个新的1.5 mL离心管中；
(5)显色剂:1000XSYBRGREEN I荧光染料，分装200 yL放入一个新的棕色1.5 mL
离心管中。
[0021]用上述试剂盒按以下方法对待测样品进行检测:
(O提取待测样品的基因组DNA:采用北京天根公司生产的植物DNA提取试剂盒方法，提取待测样品的基因组DNA，稀释至25 ng/yL；
(2)配制待测样品的LAMP检测反应体系:采用25μ L的反应体系，在200 μ L反应管内依次加入灭菌去离子水或超纯水15.5 μ L、模板DNA 2 μ L、检测引物溶液I yL、BstDNA聚合酶I μ L、10 X反应缓冲液2.5 μ L、dNTPs溶液3 μ L ;
(3)运行LAMP扩增反应:将反应管放置在恒温水浴锅中，65°C孵育60min，80°C孵育5min终止反应；
(4)LAMP扩增结果的鉴定:在LAMP扩增产物中加入I PL的显色剂，混匀，若反应管显现绿色则为阳性，若显现橙色则为阴性。
[0022]实施例2试剂盒及检测方法的特异性实验。
[0023]对实施例1所述的试剂盒及其检测方法的特异性进行实验，测试样品既包括转基因大豆样品，也包括一些常见的转基因玉米、水稻、棉花、油菜样品，共17种，分别为:
(1)转基因大豆M0N87701(含量为1%)；
(2)转基因大豆M0N87705(含量为1%)；
(3)转基因大豆M0N87708(含量为1%)；
(4)转基因大豆M0N87769(含量为1%)；
(5)非转基因大豆阴性对照；
(6)转基因大豆混合样品SI(含有M0N87701、M0N87705、M0N87708、M0N87769，每种转基因成分的含量为5%)；
(7)转基因大豆混合样品S2(含有M0N87701、M0N87705、M0N87708、M0N87769，每种转基因成分的含量为1%);
(8)转基因大豆混合样品S3(含有M0N8770UM0N87705，每种转基因成分的含量为1%);
(9)转基因大豆混合样品S4(含有M0N87708、M0N87769，每种转基因成分的含量为1%);
(10)转基因大豆混合样品S5 (含有皿^89788、40-3-2、45547、六2704、305423、356043、CV127，每种转基因成分的含量为1%);
(11)转基因玉米混合样品S6 (含有 Bt 11、Bt 176、M0N810、M0N863、NK603、GA21、TC 1507、T25，每种转基因成分的含量为1%);
(12)转基因水稻混合样品S7(含有KF-6、TT51-1，每种转基因成分的含量为1%);
(13)转基因棉花混合样品S8(含有M0N531、M0N15985、GHB614，每种转基因成分的含量为1%)；
(14)转基因油菜混合样品S9(含有MSl、RFl、T45、0xy235，每种转基因成分的含量为
1%)；
(15)非转基因大豆对照SlO；
(16)非转基因作物对照Sll(含有非转基因玉米、水稻、棉花、油菜)；
(17)超纯水空白对照。
[0024]本实施例中，仅在含有转基因大豆M0N87701的样品反应管中显现绿色，表明本发明所述的试剂盒及检测方法对转基因大豆M0N87701具有很好的特异性。
[0025]应当说明的是，上述实施例为本发明的具体实施例子，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
【主权项】
1.转基因大豆M0N87701的LAMP检测引物组，包括外引物F3、外引物B3、内引物FIP、内引物BIP和环引物LB，其核苷酸序列分别如下所示:外引物 F3:GATATGAAGATACATGCTTAGCA (SEQ ID NO:I)；外引物 B3:CGACCACGGAAAAAAAACAC (SEQ ID NO:2)；内引物 FIP:CAGATTGTCGTTTCCCGCCTTTTCGCTTAGTGTGTGGTGTC (SEQ ID NO:3);内引物 BIP:CGGGGGATCCACTAGTTCTAGTTTTGAATTCGAGCTCGGTAC (SEQ ID NO:4);环引物 LB:GCCGCGTTAACTGCAGGT (SEQ ID NO:5)。2.转基因大豆M0N87701的LAMP检测试剂盒，包括以下组分: (1)检测引物溶液:由权利要求1所述的5条引物配制的检测引物溶液，外引物F3、夕卜引物B3、内引物FIP、内引物BIP和环引物LB的浓度依次为4~6 MmoI/L,4-6 Mmol/L、32-48Mmol/L、32~48 Mmol/L和 4~6 Mmol/L ； (2)具有链置换活性的DNA聚合酶:浓度为7?9U/ μ L ; (3)1X 反应缓冲液:200 mmol/L Tris-HCl、pH 8.8，100 mmol/L KCl, 100 mmol/L(NH4)2SO4,40-100 mmol/L MgSO4,6-14 mol/L 甜菜碱； (4)dNTPs溶液，由浓度分别为10 mmol/L的dATP、dCTP、dGTP、dTTP四种脱氧核糖核苷酸溶液等体积混合而成； (5)显色齐IJ:1000XSYBR GREEN I 荧光染料。3.根据权利要求2所述的LAMP检测试剂盒，其特征在于:所述的检测引物溶液中含有5Mmol/L 外引物 F3、5 Mmol/L 外引物 B3、40 Mmol/L 内引物 FIP、40 Mmol/L 内引物 BIP、5Mmol/L环引物LB。4.根据权利要求2所述的LAMP检测试剂盒，其特征在于:所述的具有链置换活性的DNA聚合酶为Bst DNA聚合酶，浓度为8 U/μ L05.根据权利要求2所述的LAMP检测试剂盒，其特征在于:所述的10X反应缓冲液中MgSOzp甜菜碱的浓度分别为80 mmol/L、8 mol/L06.利用权利要求2~6任一项所述的试剂盒检测转基因大豆M0N87701的方法，包括以下步骤: (1)提取待测样品的基因组DNA； (2)配制待测样品的LAMP检测反应体系:在200μ L反应管内加入模板DNA 2~5 μ L、检测引物溶液I μ L、Bst DNA聚合酶I μ L、10 X反应缓冲液2.5 μ UdNTPs溶液2~5 μ L，用灭菌去离子水或超纯水补齐至总体积为25 μ L ; (3)运行LAMP扩增反应:63~65°C孵育30~60min，80°C孵育5min终止反应； (4)LAMP扩增结果的鉴定:在反应管中加入1~2μ L显色剂，通过肉眼观察显色结果来判断扩增结果。
【专利摘要】本发明公开了一种转基因大豆MON87701的LAMP检测引物组、试剂盒及检测方法。引物组由5条特异性引物组成，其核苷酸序列如SEQ？ID？NO：1~5所示。检测试剂盒包括检测引物溶液、具有链置换活性的DNA聚合酶、10×反应缓冲液、dNTPs溶液、显色剂。检测方法是采用特异性引物及具有链置换活性的DNA聚合酶，在63~65℃对样品DNA模板进行扩增，并采用加入显色剂观察颜色变化的方法，判断样品是否含有转基因大豆MON87701成分。本发明不需要特殊仪器，具有快速高效、操作简便、特异性强等特点，适合现场检测。
【IPC分类】C12N15/11, C12Q1/68
【公开号】CN105039555
【申请号】CN201510485478
【发明人】李飞武, 闫伟, 李葱葱, 邢珍娟, 董立明, 夏蔚, 邵改革, 刘娜, 龙丽坤, 张明
【申请人】吉林省农业科学院
【公开日】2015年11月11日
【申请日】2015年8月10日