, 14-C)，78. 2 (CH，15-C)，131. 7 (CH，16-C)，131. 9 (CH，17-C)， 44. 9 (C，18-C)，99. 0 (C，19-C)，72. 7 (CH，20-C)，150. 3 (C，21-C)，31. 1 (CH2, 22-C)，64. 2 (CH， 23-C)，35. 1 (CH2, 24-C)，86. 1 (CH，25-C)，205. 1 (C，26-C)，19. 3 (CH3, 27-C)，16. 7 (CH3， 28-C)，20. 5(CH3,29-C)，113. 9(CH，30-C)，166. 2(C，31-C)，22. 9(CH3,32-C)，22. 9(CH3， 33-C)，120. 0 (CH，34-C)，166. 1 (C，35-C)，50. 7 (CH3, 36-C)，50. 7 (CH3, 37-C)，177. 6 (C， l'-C)，38. 5(C，2'-C)，26. 8(CH3,3'-C)，26. 6(CH3,4'-C)，26. 7(CH3,5'-C)，171. 9(C，1"-C)， 35.8(CH2,2"-C)，18.1(CH2,3"-C)，13.2(CH3,4"-C);碳原子标记参见图 1。紫外光谱显示 该化合物在225nm有吸收。IR谱表明该化合物含有羟基（3460m1)和羰基（1724cm1)基 团。1HNMR谱表明该化合物含有十一个甲基信号，一个丁酰氧基，一个2, 2-二甲基丙酰氧 基，两个三取代双键，一个两取代双键，以及酮羰基和内酯羰基。13CNMR谱显示有46个碳 原子，包括十一个甲基，十个亚甲基，十一个次甲基（七个含氧，四个烯烃碳），十四个季碳 (七个羰基碳，两个含氧季碳，两个烯烃碳）。HMBC谱中，H-25(SH5. 13)与C-1(SC171.8) 的相关性，以及C-25(SC86. 1)的低场化学位移表明C-1和C-25通过氧原子连接。由于 H-16 (SH5. 32,ddd，J= 1. 2, 7. 2,15. 6)与H-17 (SH5. 83,d，J= 16. 2)之间较大的耦合常 数（16. 2Hz)，故C-16(SC131. 7)与C-17(SC131. 9)之间的共辄双键为反式结构。NOESY谱 中，H-20 (SH4. 90,s)和H-34 (SH5. 97,s)相关性的增强，以及H-34 和H2-22 (SH1. 94,m; 3. 61，m)相关性的减弱表明C-21 (SC150. 3)与C-34(SC120. 0)之间双键为反式构结构。 NOESY谱中，H-5 与H-7,H-7 与H3-29,H3-29 与H-ll，H-11 与H-15,H-15 与H-17 的相关性 表明这些质子为a构型，H3-32与19-OH，H3-32与H-20,H-20与19-OH的交叉峰，表明它 们为0构型。综合氢谱、碳谱、HMBC谱和NOESY谱，以及文献关于相关类型核磁数据，可基 本确定该化合物如图1所示，立体构型进一步通过ECD试验确定，理论值与实验值基本一致 (图 2)。
[0025] 实施例2 :化合物（I)药理作用试验
[0026] -、材料和仪器
[0027] 腺样囊性癌细胞系SACC-M购自上海交通大学医学院口腔颂面外科实验室。化合 物（I)自制，HPLC归一化纯度大于98%。RPMI-1640培养基、胰蛋白酶购于美国SIGMA公 司。标准胎牛血清购自邢台市汇丰生物技术研究所。Annexin-v-FITC/PI试剂盒购于北京 宝赛生物技术有限公司。PBS购于天津市光复精细化工研究所。MTT粉购于Amresco公司。 二乙胺四乙酸二钠（EDTA)购于北京益利精细化学品有限公司。青霉素、链霉素购于华北制 药有限公司。二甲基亚砜（DMS0)购于天津标准科技有限公司。Giemsa染液购于珠海贝索 技术有限公司。
[0028]XYJ型医疗净化工作台（苏州净化设备有限公司），BB5060/BB16二氧化碳培养箱 (上海Heraeus公司），CX21光学显微镜（日本OLYMPUS)，XD-10198101倒置显微镜（江南 公司），流式细胞仪（BectionDickinsonFacscaLibur)，WeLLscanMK3 全自动酶标仪（芬 兰LabsystemsDragon)，BFX5-320型低速离心机（中国上海於南科学仪器联营厂），GF-300 型电子天平（JapanA&DCompany，Limited)，725 型超低温冰箱（FormaScientific.Inc)，微 量加样器（EPPEND0RF公司）。
[0029] 二、试验方法
[0030] 1、细胞培养
[0031] 1.1细胞复苏
[0032] 预备37 °C恒温水浴箱，将液氮保存的SACC-M细胞冻存管取出，直接投入水浴箱， 轻轻摇动，待其迅速融化后，从水箱中取出冻存管，此步骤宜快，应在30-60秒内完成。之后 以75%酒精擦拭消毒管口后开启冻存管，将管内细胞悬液吸出，滴入50mL离心管并在离心 管中滴加10倍以上含10%血清的RPMI-1640培养液，轻轻吹打，使其成为细胞悬液，低速离 心（1000转/分）5分钟后，吸去上清液，再用10%的RPMI-1640培养液洗涤一次，并再次离 心，吸去上清液后，用含有10%胎牛血清的RPMI-1640培养液将细胞稀释成细胞悬液，接种 于50mL培养瓶中，轻轻抒松瓶盖，然后放入C02培养箱中培养，第二日更换一次培养液，之 后在培养液颜色由淡红变黄后更换培养液，观察细胞爬满瓶底壁的80 %时，进行细胞传代。
[0033] 1. 2细胞传代
[0034] 首先使用弯头吸管吸取原培养液后，反复吹打瓶底，之后去除瓶内旧培养液，向瓶 内加入混合消化液（0. 25%胰蛋白酶和0. 04%EDTA1:1)少量（以能够完全覆盖培养瓶底 为宜），缓慢摇动瓶身使消化液浸湿瓶底，然后吸去大部分消化液，仅留少量进行消化。将 培养瓶置于〇) 2培养箱内（或25°C室温下）进行消化，2~5分钟后取出培养瓶，放倒置显 微镜下观察，当发现胞质回缩、细胞间隙增大，部分细胞由多角形变为圆形，且已有细胞开 始悬浮时，应立即停止消化。吸出残存的消化液，加入适量不含血清的培养液，轻轻转动培 养瓶，冲掉残留的消化液后，将其吸出，再加入新培养液，用弯头吸管吸取瓶内培养液后反 复吹打瓶底，使贴。于瓶底的细胞脱离，形成细胞悬液，注意吹打时动作要轻柔，以防用力过 猛，使细胞受损。吸取细胞悬液置于离心管内，离心后，去上清，收集细胞，加入适量含10% 胎牛血清的RPMI-1640培养液，将细胞吹打成混悬液，计数，以1. 0X105/mL浓度接种在新 的培养瓶内。
[0035] 2、MTT比色试验
[0036] (1)接种细胞：取对数生长期细胞，用含有10%胎牛血清的1640培养液制成浓度 为2X105/mL的单细胞悬液，接种于96孔板内，每孔100yL。（2)培养细胞：将上述96孔 板置于C02培养箱，在37°C、5%C02以及饱和湿度条件下，继续培养24h。（3)加药：用药组 每孔加入稀释后的化合物（I)药液100yL，使其终浓度为2. 5、5. 0、7. 5、10、12. 5mmol/L; 对照组每孔加100yL不含血清的1640培养液。用药组和对照组每组均设6个复孔，并设 调零孔，加药后继续培养。（4)呈色：继续培养24h、48h和72h后，用药组和对照组每孔加 入浓度为5g/L的MTT溶液20yL，继续培养4h后，吸去全部上清液，在各孔中加入200yL 的二甲基亚砜（包括调零孔），置振荡器上振荡摇匀1分钟，使结晶充分溶解。（5)比色：将 96孔板置于酶标仪上，在波长为490nm处，测定各孔吸光度值（A)。重复实验3次，取其平均 值。（6)计算并绘图：细胞增殖抑制率=(1-用药组平均A值/对照组平均A值）X100%。 根据以上公式计算各浓度的生长抑制率，然后以时间为横轴，抑制率为纵轴，绘制5个浓度 的抑制率曲线。
[0037] 3、流式细胞术检测
[0038] 3. 1细胞的处理
[0039] 细胞接种、培养后，取对数生长期细胞，以2X105/mL浓度接种于6孔板中，而后加 药，设时间对比组、浓度对比组和对照组（正常凋亡组）：（1)时间对比组：将细胞接种于6 孔板中，培养24小时，细胞贴壁后，用吸管沿各孔壁将原培养液彻底吸出，然后于各孔加入 等量的终浓度为12. 5mmol/L含化合物（I)药液的培养液（用药组）。加入不含化合物 (I)的培养液作为对照组，分别继续培养24h、48h、72h。（2)浓度对比组：细胞接种并贴壁 成功后，用吸管彻底吸净原培养液，各孔中分别加入终浓度为2. 5、5. 0、7. 5、10、12. 5mmol/L 的含化合物（I)培养液（用药组）。对照组加入不含化合物（I)的培养液，继续培养 72h。（3)正常凋亡组：接种细胞并贴壁成功后，去除各孔中原培养液，加入不含化合物（I) 的培养液，继续培养24h、48h、