72h。
[0040] 3. 2样品的制备
[0041] (1)收集细胞：分别吸取6孔板各孔上清液，加入离心管中，取PBS液2mL漂洗6孔 板各底壁后，倒入同一离心管内，然后将2mL混合消化液滴入各孔中消化细胞，缓慢摇动培 养板使消化液完全浸湿其底壁，消化2min后将消化液吸入各离心管，再加入2mL培养液吹 打各孔底壁，细胞彻底脱壁后，吸入离心管中。（2)离心细胞：将离心管置于低速离心机中， 于1500rpm离心5min后，弃去上清液；加入12mLPBS液重悬细胞，再于1500rpm离心5min， 弃上清液；再滴入3mL的PBS液于离心管中重悬细胞后，将细胞悬液吸至流式细胞仪专用上 机管中，1500rpm离心5min后，弃上清液。
[0042] 3. 3Annexin-V-FITC和PI双标记活细胞法检测细胞凋亡
[0043] (1)用微量加样器向流式管中加入10yL的Annexin-V-FITC和5yL的PI(两种 试剂勿相混，勿和管底细胞相接触）。（2)加入200yL结合缓冲液，将Annexin-V-FITC和 PI冲至管底与细胞相混，并轻轻吹打，形成单细胞悬液。（3)避光反应15min或放入4°C冰 箱30min。（4)上机前加入300yLPBS结合缓冲液，并轻轻吹打，而后立刻上机（流式细胞 仪）检测。光源为488nm氩离子激光器，每份标本收集细胞10000个，FITC受激发后发绿 色荧光，PI发红色荧光。（5)经流式细胞仪分析，获得由四个象限组成的散点图，图上每一 个点代表一个细胞，都具有两个参数值。左上Q1象限代表细胞收集过程中出现的损伤细胞 (An-PI+)，右上Q2象限代表晚期凋亡细胞和坏死细胞（An+PI+)，左下Q3象限代表正常细胞 (An-PI-)，右下Q4象限代表早期凋亡细胞（An+PI-)。
[0044] 4、统计学分析
[0045] 使用统计学软件SPSS10.0进行统计分析。（1)使用析因设计的方差分析，对相同 药物浓度不同处理时间、相同处理时间不同药物浓度各组之间化合物（I)对SACC-M细胞 的生长抑制率进行两两比较。（2)使用简单相关分析，分析生长抑制率与作用时间之间、抑 制率与药物浓度之间的相关性，得出相关系数r，并对r值进行t检验，从而得出药效随时间 和浓度的变化关系。（3)使用二项分布的u检验对流式细胞术检测的各用药组及对照组的 凋亡率进行统计分析。
[0046] 三、结果及结论
[0047] 1、MTT比色试验
[0048] (1)实验表明化合物（I)对SACC-M细胞有明显的增殖抑制作用，药物作用24、 48、72h后最高抑制率可达80. 4% (表1)。（2)相同处理时间、不同浓度组之间的抑制率比 较有明显差异（P〈〇. 01);相同浓度组、不同处理时间之间的抑制率有明显差异（P〈〇. 01); 药物浓度和处理时间无交互作用（P= 〇. 901)。（3)组间两两比较：相同时间、不同浓度组 之间，抑制率有明显差异（P〈〇. 01);处理24h、48h、72h后，同一浓度、不同时间组之间有明 显差异（P〈〇. 01)。（3)药效（抑制率）与作用时间和药物浓度均具有正相关性，抑制率与 作用时间具有正相关性（r= 0. 291，P= 0. 042);抑制率与浓度具有正相关性（r= 0. 926， P〈0. 001)。
[0049] 2、流式细胞术检测
[0050] 2. 1对照组细胞的凋亡情况
[0051] 对照组（正常凋亡组）细胞均属于自然凋亡，24h时其凋亡率为4. 9 %，48h时的凋 亡率为7. 1 %，72h的凋亡率为6. 1 % (表2)，凋亡率随培养时间差别不大，无统计学意义。
[0052] 2. 2用药组细胞随时间变化凋亡情况
[0053] 经12.5mmol/L化合物（I)处理24h后，其凋亡率为25.5%;处理48h后，凋亡 率上升至40. 9 %，多为早期凋亡；处理72h后，凋亡率为67. 6 %，多为晚期凋亡，细胞凋亡率 随着处理时间延长而明显上升（表2)，各时间组之间凋亡率有统计学意义（P〈0. 01)。
[0054] 2. 3用药组细胞随浓度变化凋亡情况
[0055] 处理72h后，2. 5、5. 0、7. 5、10. 0、12. 5mmol/L化合物（I)组的细胞凋亡率分别为 16%、24. 2%、26. 1%、66. 3%、67. 6%，且在药物浓度达到12. 5mmol/L时，晚期凋亡率明显 增大（表2)，各药物浓度组间凋亡率有统计学意义（P〈0. 01)。
[0056] 结论，本研究表明化合物（I)具有诱导SACC-M凋亡的作用，且凋亡率随药物作 用时间的延长和用药浓度的增加呈上升趋势。应用化合物（I)治疗腺样囊性癌有可能成 为一种很有前景的治疗方法。
[0057] 表1不同浓度不同作用时间抑制率（均值土SD)
[0058]
[0061] 实施例3
[0062] 片剂的制备：按实施例1方法先制得化合物（I)，以及利用有机酸如酒石酸、或 柠檬酸或甲酸或乙二酸等、无机酸如盐酸或硫酸或磷酸制成的盐，按其与赋形剂重量比为 1:9的比例加入赋形剂，制粒压片。
[0063] 实施例4
[0064] 口服液制备：按实施例1方法先制得化合物（I)，以及利用有机酸如酒石酸、或 柠檬酸或甲酸或乙二酸等、无机酸如盐酸或硫酸或磷酸制成的盐，按常规口服液制法制成 口服液。
[0065] 实施例5
[0066] 胶囊剂或颗粒剂的制备：按实施例1方法先制得化合物（I)，以及利用有机酸如 酒石酸、或柠檬酸或甲酸或乙二酸等、无机酸如盐酸或硫酸或磷酸制成的盐，按其与赋形剂 重量比为1:9的比例加入赋形剂，制成胶囊或颗粒剂。
[0067] 实施例6
[0068] 注射液的制备：按实施例1方法先制得化合物（I)，以及利用有机酸如酒石酸、 或柠檬酸或甲酸或乙二酸等、无机酸如盐酸或硫酸或磷酸制成的盐，按常规加注射用水，精 滤，灌封灭菌制成注射液。
[0069] 实施例7
[0070] 无菌粉针的制备：按实施例1方法先制得化合物（I)，以及利用有机酸如酒石 酸、或柠檬酸或甲酸或乙二酸等、无机酸如盐酸或硫酸或磷酸制成的盐，将其溶于无菌注射 用水中，搅拌使溶，用抽滤漏斗过滤，无菌精滤，分装于安瓿中，低温冷冻干燥后无菌熔封得 粉针剂。
【主权项】
1. 具有下述结构式的化合物（I)，2. 权利要求1所述的化合物（I)的制备方法，其特征在于包含以下操作步骤：(a)将 合子草的干燥叶粉碎，用80~90%乙醇热回流提取，合并提取液，浓缩至无醇味，依次用石 油醚、乙酸乙酯和水饱和的正丁醇萃取，分别得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇 萃取物；(b)步骤（a)中乙酸乙酯萃取物用大孔树脂除杂，先用15%乙醇洗脱8个柱体积， 再用75 %乙醇洗脱12个柱体积，收集75 %乙醇洗脱液，减压浓缩得75 %乙醇洗脱物浸膏； (c)步骤（b)中75%乙醇洗脱物浸膏用正相硅胶分离，依次用体积比为85:1、55:1、35:1、 15:1和1:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到5个组分；（d)步骤（c)中组分4用正相硅胶 进一步分离，依次用体积比为20:1、15:1和10:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到3个组分； (e)步骤（d)中组分2用十八烷基硅烷键合的反相硅胶分离，用体积百分浓度为80%的甲 醇水溶液等度洗脱，收集8~10个柱体积洗脱液，洗脱液减压浓缩得到纯的化合物（I)。3. 根据权利要求2所述的化合物（I)的制备方法，其特征在于：步骤（a)中，用85% 乙醇热回流提取，合并提取液。4. 根据权利要求2所述的化合物（I)的制备方法，其特征在于：所述大孔树脂为AB-8 型大孔吸附树脂。5. -种药物组合物，其特征在于：该药物组合物含有治疗有效量的权利要求1所述的 化合物（I)和药学上可接受的载体。6. 权利要求1所述的化合物（I)在制备治疗涎腺腺样囊性癌的药物中的应用。7. 权利要求5所述的药物组合物在制备治疗涎腺腺样囊性癌的药物中的应用。
【专利摘要】本发明公开了一种新的大环内脂类化合物及其制备方法和医药用途。该化合物为首次报道，是一种结构新颖的大环内脂类化合物，可以从合子草的干燥叶中提取、分离纯化得到。体外试验证明该化合物具有诱导SACC-M凋亡的作用，且凋亡率随药物作用时间的延长和用药浓度的增加呈上升趋势，可以用来开发成治疗涎腺腺样囊性癌的药物。
【IPC分类】A61P35/00, C07D493/22, A61K31/365
【公开号】CN105131013
【申请号】CN201510677510
【发明人】高忠青
【申请人】淄博夸克医药技术有限公司
【公开日】2015年12月9日
【申请日】2015年10月18日