甲瓒，用酶联免疫检测仪在570nm 处检测其吸光值。细胞数在一定的范围内，MTT形成的甲瓒结晶的量与活细胞数成正比，所 以，这种方法可以间接反映活细胞的数量。细胞存活率按下面公式进行计算：
[0046] 细胞存活率（％ )=加药组0D/对照组0DX100%
[0047] 实验方法：
[0048] 1)取 3X104cells/mLIfepG2 细胞 100yL接种于到 96 孔板中，在 5%C02,37°C环 境下用RPMI-1640培养基孵育24h。
[0049] 2)换取90mL新鲜培养基，加入10yL不同浓度的姜黄素或姜黄素类似物作用 48h〇
[0050] 3)弃去培养基，每孔加入110yLMTT溶液（5mg/mL，即0? 5%MTT)继续作用4h。
[0051] 4)弃去培养基，加入100yLDMS0并置于摇床上低速震荡，使结晶物充分溶解。在 酶联免疫检测仪570nm处检测各孔的吸光值。
[0052] 天然产物curcumin(姜黄素）与本发明的姜黄素类似物对IfepG2细胞的增殖抑制 活性实验结果见表1。
[0053] 表1 (IC5。表示化合物的半致死浓度）
[0054]
[0055] 结论：本发明的姜黄素类似物对人肝癌HepG2细胞的增值抑制活性为15. 1yM，明 显优越于天然产物curcumin(52. 3yM)，并且呈现良好的浓度依赖性，可以用作治疗肝癌的 姜黄素类先导物。
[0056] 本发明的姜黄素类似物对IfepG2细胞增殖抑制活性的浓度依赖性曲线见图4。
[0057] 结论：本发明的姜黄素类似物对IfepG2细胞增殖抑制活性具有良好的浓度依赖 性。
[0058] 实施例3
[0059] 本发明的姜黄素类似物通过Annexin-VFITC/PI双染凋亡测定细胞凋亡分析
[0060] 为了证实本发明的姜黄素类似物抑制癌细胞增殖活性是否与其诱导凋亡活性相 关，我们使用流式细胞仪采用Annexin-VFITC和PI双染法量化分析了本发明的姜黄素类 似物诱导细胞凋亡情况。
[0061] 实验原理
[0062] 磷脂酰丝氨酸（phosphatidylserine，PS)正常情况下位于细胞膜的内侧，细胞发 生凋亡的早期，细胞膜内外的不同的磷脂基团重新分布，PS外翻。AnnexinV是一种Ca2+ 依赖性磷脂结合蛋白，在Ca2+存在下，与PS有很高的亲和力，能与PS特异性地结合，因此， AnnexinV能区分PS暴露和未暴露的细胞。AnnexinV不能区分凋亡细胞和坏死细胞，通 过与区别死细胞和活细胞的染料PI结合，进行双染色，就能区别活细胞、凋亡细胞和坏死 细胞。活细胞不能被AnnexinV-FITC和PI染色，细胞膜未受损的凋亡早期细胞，仅能被 AnnexinV-FITC染色，坏死细胞及凋亡晚期的细胞可以被AnnexinV-FITC和PI双染色。
[0063] 实验步骤：
[0064] 1)2. 5mL的IfepG2细胞以2X105cells/mL的密度接种于到六孔板中，于5%C02， 37°C的培养箱中培养24h。
[0065] 2)换上新鲜的培养基，并加入不同浓度（12. 5、25、37. 5和50yM)的3,3' -羟基 姜黄素类似物作用24h。（如果测定GSH和NAC对凋亡的抑制作用，5mM的GSH和NAC预先 孵育lh，再加入50yM本发明的姜黄素类似物作用24h)。
[0066] 3)收集细胞：胰酶消化细胞，并收集细胞于含有血清的eppendorf管中。
[0067] 4)室温200g离心lOmin，去除培养基。
[0068]5)用lmL预冷的PBS溶液将细胞轻轻重悬。
[0069] 6)室温200g离心lOmin，去除PBS溶液，洗涤两次。
[0070] 7)调整细胞密度，使细胞以1X106cells/mL的密度重悬于预冷的1X结合缓冲液 中。
[0071] 8)对照组取200yL细胞悬液于60 °C水浴中加热5min，然后均分为两份，一 份为PI阳性对照，只加5yLPI染液，另一份为Annexin-V/FITC阳性对照，只加5yL Annexin-V/FITC染色液。
[0072] 9)其余每个实验组，取100L细胞悬液先加入5yLAnnexin-V/FITC染色液，再加 入5yLPI染液，室温避光孵育15min，加入400yL结合缓冲液，立即用流式细胞仪检测分 析。
[0073] GSH和NAC对本发明的姜黄素类似物诱导的HepG2细胞凋亡的抑制结果见图5。
[0074] 结论：本发明的姜黄素类似物能显著地诱导IfepG2细胞凋亡，并且其活性顺序与 抑制细胞增殖活性顺序相一致。这说明它们抑制细胞增殖活性主要来自于其诱导凋亡的活 性，尤其是50yM3, 3' -羟基姜黄素类似物诱导中晚期凋亡细胞的比例达到80. 2%。
[0075] 实施例4
[0076]DCFH-DA测定活性氧（R0S)
[0077] 姜黄素诱导细胞凋亡可通过促进R0S的产生，为了证实本发明的姜黄素类似物诱 导细胞凋亡的过程中也产生了R0S，我们使用流式细胞仪和荧光探针2'，7' -二氯二氢荧光 素二乙酯（DCFH-DA)检测了细胞内活性氧水平。
[0078] 实验原理
[0079]DCFH_DA(2'，7'-dichlorofluorescindiacetate)常用于测定细胞内活性氧的动 态变化。其原理是：DCFH-DA进入细胞内后，经过酯酶作用脱去二酯，生成DCHL然后DCFH 被超氧阴离子、过氧化氢等活性氧氧化生成可以发荧光的DCF。活性氧的含量与荧光探针的 荧光强度呈正相关，因此可以通过检测DCF的荧光强度来定性及定量监测活性氧的变化。
[0080] 实验步骤：
[0081] 1)2. 5ml的IfepG2细胞以2X105cells/mL的密度接种于到六孔板中，于5%C02， 37°C的培养箱中培养24h。
[0082] 2)换上新鲜的培养基，并加入50yM3, 3'-羟基姜黄素类似物作用3h和6h。（如 果要测定6311和嫩(：对1^的清除作用，511116311和51111嫩(：预先孵育111，再加入3,3'-羟 基姜黄素类似物作用3h和6h。）。
[0083] 3)收集细胞：胰酶消化细胞，并收集细胞于含有血清的eppendorf管中。
[0084] 4)室温200g离心lOmin，去除培养基。
[0085] 5)用lmL的PBS溶液将细胞轻轻重悬。
[0086] 6)室温200g离心10min，去除PBS溶液，洗涤两次。
[0087] 7)细胞重悬于400yL含有3. 0yM的（DMS0配置为3mM的储备液，-20°C保存） DCFH-DA的PBS染液中，37°C孵育 30min。
[0088] 8)室温200g离心10min，去除DCFH-DA染液，用700yLPBS洗涤两次。
[0089] 9)使细胞重悬于800yLPBS中，流式细胞仪检测分析。
[0090] 本发明的姜黄素类似物与姜黄素促进IfepG2细胞R0S的产生结果见图6
[0091]结论：
[0092] 本发明的姜黄素类似物作用3h和6h后均可促进R0S的产生，并且呈现出良好的 浓度依赖性。更为重要的是，与姜黄素相比，3, 3'-羟基姜黄素类似物能够更加快速地诱导 R0S的产生，50yM姜黄素类似物作用6h后就能使R0S水平达到空白对照组的5倍左右。
[0093] 实施例5
[0094]GSH/GSSG的测定
[0095] 谷胱甘肽是哺乳动物细胞中含量最高的硫醇，它以还原型（GSH)和氧化型（GSSH) 两种形式存在于胞内。GSH/GSSG的比值直接反映着细胞中的氧化还原状态，也是衡量这种 状态改变的最重要的指标。因此，通过测定H印G2细胞内GSH和GSSG含量的变化，可分析 本发明的姜黄素类似物是否诱导了胞内氧化还原状态的失衡。
[0096] 实验原理：
[0097] 采用的是动力学测定方法。首先，测定不同浓度的GSH和GSSG标准溶液与DTNB 的动力学反应，监测5min，计算出反应速率（AOD/S)，然后以不同浓度的GSH或GSSG的反 应速率（A0D/S)为纵坐标，GSH或GSSG的浓度为横坐标作图，得到标准曲线。
[0098] 实验步骤：
[0099] l)IfepG2细胞以5X105cells/孔种植于六孔板中，于5%C02,37°C的培养箱中培 养24h。
[0100] 2)换上新鲜培养基，首先加入20yM的化合物3, 3' -羟基姜黄素类似物作用6h， 测定GSH/GSSG的比例，选择具体作用时间。
[0101] 3)收集细胞，用PBS洗2次，300g离心lOmin。
[0102] 4)细胞悬浮于冷的500yL10mmol/L的稀HC1中，涡旋5s，于液氮和37°C水浴 中反复冻融3次裂解细胞（用细胞冻存管，因为国产eppendorf管质量不好），每次冻融 3-5min〇
[0103] 5)取40yL用于测定蛋白浓度，剩余样品加入120yL预冷的6. 5%SSA中立即涡 旋，4°C静置 10min。
[0104] 6)8000g4°C离心15min，取上清。取5yL测定细胞总GSH水平。
[0105] 7)另取100yL于96孔板中，每孔加入5yL2-乙烯基吡啶去除GSH，室温震荡 lh，取40yL用于测定GSSG。
[0106] 3, 3' -羟基姜黄素类似物对IfepG2细胞氧化还原平衡的影响结果见图7
[0107] 结论：3, 3' -羟基姜黄素类似物能显著地改变细胞内的氧化还原平衡，并呈现出 良好的浓度依赖关系。
[0108] 实施例6