7] HLyb-278 ;ACTAGCTATCGATACTCGAAC
[0158] CACACAGACTTAATCCACACACATAAAATCTATTCAA CACATGTGAGATTAACTGGACA 阳159] HLyb-281 ;ACTAGCTATCGATACTCGAAC
[0160] CCATTCGTCTACACACCTTATACATCCTCATTTACCC CACATGTGAGATTAACTGGACA
[0161] HLyb-282 ;ACTAGCTATCGATACTCGAAC
[0162] CACCTTGTACATCCATCATTTACCCCTATAACTCTCA CACATGTGAGATTAACTGGACA
[0163] HLyb-288 ;ACTAGCTATCGATACTCGAAC
[0164] TCTCAATACACCCATAAGAAACCTCACATTCATTACC CACATGTGAGATTAACTGGACA 阳1化]HLyb-292 ;ACTAGCTATCGATACTCGAAC
[0166] AACTCCACAGCATAACACTTACCCTCATTAATATCCA CACATGTGAGATTAACTGGACA
[0167] HLyb-315 ;ACTAGCTATCGATACTCGAAC
[0168] ATTAATATGCCATCACTACCCATCCCCTTTACTACTC CACATGTGAGATTAACTGGACA
[0169] HLyb-328 ;ACTAGCTATCGATACTCGAAC
[0170] CATCCCCTGTTACTAACTCTCTCTCAATCTACACCCC CACATGTGAGATTAACTGGACA
[0171] HLyb-341 ;ACTAGCTATCGATACTCGAAC
[0172] ACCCACTTGTCTTTTAAATAAACAATACCTCCCATCC CACATGTGAGATTAACTGGACA
[0173] HLyb-367 ;ACTAGCTATCGATACTCGAAC
[0174] AACCACCACGCCAAATACATTCTCATCTAACATTCCC CACATGTGAGATTAACTGGACA 阳1巧]HLyb-380 ;ACTAGCTATCGATACTCGAAC
[0176] TTCCGCCCTTTACTATCCACCATCATCTTATCATAAA CACATGTGAGATTAACTGGACA
[0177] HLyb-419 ;ACTAGCTATCGATACTCGAAC
[0178] ATACTACTTCGTCTATCTATTCTTTATTTATTCATCC CACATGTGAGATTAACTGGACA 阳1巧]HLyb-432 ;ACTAGCTATCGATACTCGAAC
[0180] TTTATTCATCCGCATCTTACTCCAATCACTATTAAAC CACATGTGAGATTAACTGGACA
[0181] HLyb-458 ;ACTAGCTATCGATACTCGAAC
[0182] ATCACTATTAGAAACCACAAAACACTTTAACCTTCAC CACATGTGAGATTAACTGGACA 阳18引 HLyb-471 ;ACTAGCTATCGATACTCGAAC
[0184] CCTTCACTAACCACAATTTGTTAACCCACCACCACAA CACATGTGAGATTAACTGGACA阳化5] HLyb-497 ;ACTAGCTATCGATACTCGAAC
[0186] ATTCCACATCTCACATCATATATTTCTACCCGCTCTA CACATGTGAGATTAACTGGACA
[0187] HLyb-510 ;ACTAGCTATCGATACTCGAAC
[0188] CCCTCTAAGAAACAAAACTCTTCAATCTCATTATTTT CACATGTGAGATTAACTGGACA
[0189] HLyb-549 ;ACTAGCTATCGATACTCGAAC
[0190] TCTTCAAATCTCATTATTGTTCAATCCCTACCCTTTT CACATGTGAGATTAACTGGACA
[0191] HLyb-575 ;ACTAGCTATCGATACTCGAAC
[0192] CCCTTGTTACACACAATATACTAATACCCATAAACTT CACATGTGAGATTAACTGGACA
[0193] HLyb-588 ;ACTAGCTATCGATACTCGAAC
[0194] CTACACAATCTAATCACTTATAGACTTCAAACTTTAT CACATGTGAGATTAACTGGACA 阳1巧]HLyb-601 ;ACTAGCTATCGATACTCGAAC
[0196] TACAACACATCCATACCGAATCATCCCACATCAAAAT CACATGTGAGATTAACTGGACA
[0197] HLyb-627 ;ACTAGCTATCGATACTCGAAC
[0198] ATCCCACATCAAGAATACCAAAAACTTATCACCCTCA CACATGTGAGATTAACTGGACA
[0199] HLyb-628 ;ACTAGCTATCGATACTCGAAC 阳200] CAATCTATAAAGAATCACATCACACTCATACATATCA CACATGTGAGATTAACTGGACA 阳2〇U HLyb-633 ;ACTAGCTATCGATACTCGAAC 阳202] CCACATAAAGAATCTATTCAAAATTAATACTTTCATT CACATGTGAGATTAACTGGACA 阳203] HLyb-635 ;ACTAGCTATCGATACTCGAAC 阳204] TCACATATCCGCCAACTTCCTTTATTTCTTCTCACAA CACATGTGAGATTAACTGGACA 阳2化]HLyb-644 ;ACTAGCTATCGATACTCGAAC 阳206] CTAACTCGCACACATAACACTTACCCTCATTAATATC CACATGTGAGATTAACTGGACA 阳207] HLyb-653 ;ACTAGCTATCGATACTCGAAC 阳208] CTTTACTACTCGTCTCATCAATCTACACCCCCACCAT CACATGTGAGATTAACTGGACA 阳209] HLyb-655 ;ACTAGCTATCGATACTCGAAC
[0210] ATTCTCATCTAACATTACCGCCCTTTACTATCCCCAT CACATGTGAGATTAACTGGACA阳21U HLyb-660 ;ACTAGCTATCGATACTCGAAC
[0212] ATAAACTTTACATACCAGAAACATATCATCTCCCCAA CACATGTGAGATTAACTGGACA 阳21引HLyb-661 ;ACTAGCTATCGATACTCGAAC
[0214] ATATTCCACATCTACCATCATATATTTCTACCCGCTC CACATGTGAGATTAACTGGACA
[0215] HLyb-666;ACTAGCTATCGATACTCGAAC
[0216] ATTACACATCTACCATTTAATCAACACACCTTGTTAC CACATGTGAGATTAACTGGACA
[0217] 本发明的有益效果：（1)获得了一种能够特异高效结合霍乱病菌孔eY蛋白的适配 子。该适配子可W大量人工制备，方法简单，成本低廉。（2)W核酸适配子为基础可W制备 成为祀向霍乱病菌的诊断和治疗药物。
【具体实施方式】
[0218] 实施例1孔eY蛋白特异性结合DNA适配子的SELEX筛选
[0219]根据（The Hi曲Iy Conserved Bacterial RNase孔eY Is Essential in Vibrio cholerae，Playing a Critical Role in Virulence，Stress Regulation，and RNA P;rocessing，Maa;rten VercruysseJLOS F*athogens)文献的方法，大肠杆菌表达讯eY蛋白。 阳220] 化学合成初始寡核巧酸随机文库及引物，序列如下：（5' -ACTAGCTATCGATACTCGAA C--N37--CACATGTGAGATTAACTGGACA-3')，其中MO为37个随机寡核巧酸； 阳22U 引物Pl:ACTAGCTATCGATACTCGAAC;
[0222]引物P2 :TGTCCAGTTAATCTCACATGTG。 阳223]将单链DNA文库扩增为双链DNA，产物经2 %琼脂糖凝胶电泳并切胶回收纯化；W回收的双链DNA为模板，体外转录出单链RNA随机文库，转录产物经PAGE纯化。75yg RNA文库经硝酸纤维素膜反筛去除与膜结合的RNA分子，然后与化g孔eY37°C解育30min， 反应液经硝酸纤维素膜滤过，洗涂滤膜；然后将滤膜剪碎，置于洗脱缓冲液化mol/L尿素， 0. 55mol/L醋酸锭，1. 5mmol/L邸TA，0. 15%SD巧中煮沸5min，离心取上清，无水乙醇沉淀 RNA，并重新溶解于20yIDEPC水中；WRNA为模板RT-PCR扩增双链DNA，体外转录出RNA文 库用于下一轮筛选；每轮筛选过程中RT-PCR得到双链DNA文库，W该双链DNA为模板体外 转录出RNA适配子库，筛选共进行11轮。
[0224] 实施例2特异性高亲和力的孔eY蛋白结合适配子的获得
[0225] 将RNA适配子分别取1. 5yg，用牛小肠碱性憐酸酶（CIP) 37°C消化比，纯化回收去 憐酸化的RNA;通过T4多核巧酸激酶标记[丫 -32P]ATP于去憐酸化的RNA分子末端。IOnmol 放射性标记的RNA适配子分别与不同浓度（l-200nM)的TS/MDEP37°C解育30min，各组反 应液经硝酸纤维素膜滤过，洗涂滤膜，干燥滤膜，液闪计数仪测定滤膜上残留的放射量，同 一样品平行做两次测定。计算各个适配子与孔eY的解离常数。结果如下： 阳226] 阳227]
阳22引 CN105154449A 坑明书 11/13 页
阳229]
[0230] 实施例3所述适配子特异性分析W及稳定性分析 阳231 ] 分别采用人血白蛋白，霍乱弧菌化tX蛋白，霍乱弧菌VgrG3C蛋白，大肠杆菌外膜 蛋白A，与101条适配子进行特异性检测，经过结合试验发现，运些适配子都不与运些蛋白 相结合，而只与YbeY蛋白结合保持较高的特异性。 阳232] 将所述的适配子，取0.化g，分别置于常溫的血清、水溶液中，放置二周。通过 RT-PCR检测，发现二周的放置其结构稳定，没有被降解。 阳233] W上仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人 员来说，凡在本发明的精神和原则之内所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本 发明的保护范围之内。
【主权项】
1. 一种单链寡核苷酸适配子，其特征在于：其能特异性结合霍乱弧菌YbeY蛋白。2. 如权利要求1所述的核苷酸适配子，其特征在于：其核苷酸序列如序列表中SEQ ID No. 1-102 所述。3. 权利要求1-2所述的核苷酸适配子在制备霍乱弧菌检测试剂中的应用。4. 权利要求1-2所述的核苷酸适配子在制备靶向霍乱弧菌的药物中的应用。
【专利摘要】本发明涉及能特异结合霍乱弧菌YbeY蛋白的寡核苷酸适配子及应用。所述适配子是单链DNA分子，具有序列表中SEQ？ID？No.1-101所述的核苷酸序列。该适配子采用SELEX技术筛选获得，可用于制备霍乱弧菌的检测试剂，靶向药物的制备，具有稳定、简便、快速、经济等优点。
【IPC分类】A61K31/7088, A61P31/04, C12N15/115, G01N33/569
【公开号】CN105154449
【申请号】CN201510390013
【发明人】华国光
【申请人】华国光
【公开日】2015年12月16日
【申请日】2015年7月3日