[0112] 从緬因州巴港的杰克逊实验室（Jackson Laboratories (Bar Harbor，ME))获得几 群4至6周龄雌性C57BL/6J小鼠。通过静脉内给予每只小鼠5mg的5-氟尿嘧啶（5FU)， 对小鼠进行处理。在5FU处理后5天，从胫骨和股骨收集骨髓（BM)细胞。通过在5ml无菌 TAC缓冲液（135mM NH4CL，17mM Tris Ph 7. 65)中温育将红细胞裂解。将骨髓细胞在补加 有 5 μ g/ml 重组 Tat-Myc 和 10 μ g/ml 重组 Tat-Bcl-2 的 BM 培养基（DMEM，含有 15 % FCS、 100 单位 / 毫升的 Penn/Str印、MEM NEAA(Gibco)、10mM HEPES、重组鼠 IL-3、IL-6 和 SCF) 中扩增。
[0113] 通过将293FT细胞在DlO培养基（DMEM、10% FBSUOO单位/毫升的Penn/Str印、 MEM NEAA(Gibco)、2mM L-谷氨酰胺（Gibco))中以12X 106个细胞/板的密度接种在150mm 平板中制备细胞因子。使用磷酸钙，将细胞用30 μ g总DNA/板进行转染，该30 μ g总DNA 由 10 μ g pcDNA3. I-SCFUO μ g pcDNA3. 1-IL3 和 10 μ g pcDNA3. 1-IL6 组成或者由 10 μ g pcDNA3. 1-TP0、10 μ g pcDNA3. 1-Flt3-L 和 10 μ g pcDNA3. I-GM-CSF 组成（Young，R. Μ·，et al. (2008). B-cell receptor signaling in the genesis and maintenance of B-cell lymphoma. Future Oncology，4, 591-4) (Young，R.M.等人，2008 年，"B 细胞淋巴瘤的起源和 维持中的B细胞受体信号转导"，《未来肿瘤学》，第4卷，第591-4页））。第二天，移除培养 基并用100ml DlO培养基更换。将细胞在37°C /5% C02下温育4至5天。收集培养基，过 滤灭菌，以30ml等分试样在-20 °C下冷冻。
[0114] 将细胞培养28天，每48小时更换BM培养基以更新Tat融合蛋白。作为对照，将 骨髓细胞在含有细胞因子和Tat-Cre的培养基中培养。图3A和表1显示培养28天后所得 的HSC群体的流式细胞术分析情况。FACS分析显示Sca-1/c-kit群体（Iin-)持续富集，而 所有其他细胞类型在28天时间里下降。
[0115] 经Tat-Myc和Tat-Bcl-2处理的细胞表达高水平的c-Kit和Sca-I，并且呈现谱系 标志物阴性（表2)。
[0116] 另外，用CFSE对一部分的该细胞进行标记，证明了 HSC当在这些培养条件下维持 时活跃地增殖（图3B)。HSC的总体扩增状况在图3C和表1中示出，最终在培养28天时间 里鼠 HSC扩增了 269倍。 实例5 =Tat-Mvc和Tat-Bcl-2扩增的鼠 HSC的務棺
[0117] 将递减数目的体外扩增HSC移植到经亚致死性辐照的Rag-I /小鼠体内。如针对 NSG小鼠所描述进行向Ragl z小鼠（杰克逊实验室）体内的移植，例外的是Ragl z小鼠在 就要经尾静脉注射骨髓细胞之前接受350拉德的辐照。
[0118] 移植后四周，检查小鼠是否存在成熟T细胞和B细胞。在HSC嵌合小鼠移植了 10、 100或1000个体外扩增的HSC后，在其外周血中存在成熟的表达B220/⑶19的B细胞和表 达TCB β /CD4的T细胞（图4A、4B和表3)。
[01191 ~还在HSC嵌合小鼠的淋巴结、脾脏、胸腺和骨髓中检测到成熟T细胞和B细胞(图 4C) 0
[0120] 将从嵌合小鼠的脾脏获得的成熟鼠 T细胞和B细胞用CFSE进行标记并用抗CD3 (T 细胞）或CD40和IgM(B细胞）的单克隆抗体活化。该成熟淋巴样细胞在经它们的抗原受 体活化后能够母细胞化并进行细胞分裂（图4D)。另外，将从初始HSC嵌合小鼠组获得的骨 髓细胞用于连续移植研究。表4显示以连续方式进行了移植的Rag-I /小鼠的外周血中检 测到的成熟T细胞和B细胞的频率。
实例6 :用Tat-Mvc和Tat-Bcl-2扩增源自人脐带血的HSC
[0121] 从被本地脐带血库废弃的样品获得新鲜的脐带血细胞。所有的人细胞均去除身份 标识，免除机构审查委员会（IRB)的监督。脐带血包括0+、0_、A+、A-、B+、B-和AB+，它们 都表现出大约相同的扩增状况。
[0122] 将总脐带血体积分成20ml等分试样并在PBS中I : 1稀释。将经稀释的脐带血 (20ml)小心地覆盖在20ml的淋巴细胞分离液（Ficoll-Paque Plus)(安玛西亚生物科技 公司（Amersham Biosciences)目录号17-1440-03)上。将细胞在900x重力加速度下离心 60分钟。用玻璃吸管移取血沉棕黄层并用PBS洗涤两次。将细胞重新悬浮在FCB培养基 (伊思考夫培养基（Gibco))中，该培养基补加有以上描述的10%人血衆、100单位/毫升的 Penn/Str印、30ml的含SCF、IL3和IL6的培养基及30ml的含TP0、FLT3-L和GM-CSF的培养 基。FCB培养基在就要添加到胎儿脐带血（FCB)细胞之前还补加5 μ g/ml的重组Tat-Myc 和10 μ g/ml的重组Tat-Bcl-2。在扩增期间每3天更换培养基。
[0123] 该细胞因子混合物含有IL3、IL6、TPO、Flt3-L、SCF和GM-CSF，这在该六种细胞 因子的组合方面不同于先前报道的培养基（Suzuki，T.，et al. (2006). Stem Cells 24， 2456-65 (Suzuki，T.等人，2006年，《干细胞》，第24卷，第2456-65页）），重组Tat-Myc和 Tat-Bcl-2的添加也不同。对体外扩增的人HSC的表面表型的评估表明，人HSC在Tat-Myc 和Tat-Bcl-2存在下长期培养后保持其表面特性（图5A)。这组条件导致在培养14天中 ⑶34+细胞的数目增加86. 4倍，并且在培养21天中源自未经分级分离的脐带血的人⑶34+ 细胞的数目增加103. 8倍（图5B)。 实例7 =Tat-Mvc和Tat-Bcl-2扩增的人脐带血HSC在体外和体内具有牛物活件
[0124] 将体外扩增的人HSC接种在MethoCult Optimum(干细胞技术公司（StemCell Technologies))上，检查其产生特定的集落类型的能力。该体外扩增的人HSC能够产生 CFU-G、CFU-M、CFU-GM 和 BFU-E 集落（图 5C 和 。另外，虽然在 Tat-Myc 和 Tat-Bcl-2 存 在下扩增的HSC的表面表型在培养中保持，但它们的集落形成单位含量在这些条件下显著 富集（图OT)。在Tat-Myc和Tat-Bcl-2存在下扩增的CD34+细胞还能够产生新的BFU-E、 CFU-M、CFU-G和CFU-GM集落，而在单独培养基中培养的CD34+细胞不产生新的集落（图 5E) 〇
[0125] 对于测试体外扩增的人CD34+细胞在体内产生成熟人造血谱系的能力的实验，使 用NOD/SCID/gc-/-小鼠（NSG)作为接受小鼠。这是有记载的可用于这个目的的小鼠模 型（Tanaka，S.，et al. (2012). Development of mature and functional huamn myeloid subsets in hematopoietic stem cell-engrafted NOD/SCID/IL2rgK0 mice. J Tmmunol 188,6145-55 (Tanaka，S.等人，2012年，在植入了造血干细胞的N0D/SCID/IL2rgK0小鼠体 内发育成熟和功能性人髓样细胞亚群，《免疫学杂志》，第188卷，第6145-55页））。
[0126] 将胎儿脐带血细胞（FCB)注射到在就要进行注射之前接受了 180拉德的辐照的 NOD/SCID/gc-/-小鼠（NSG)(杰克逊实验室）体内。将扩增的FCB在PBS中洗涤3次，并 在200 μ I PBS中通过尾静脉注射。移植后八周，小鼠经尾静脉放血，以使用以下抗体通过 流式细胞术评估重构情况：抗人CD3 (hCD3) (Biolegend目录号300312)、抗人CD19 (hCD19) (Biolegend 目录号 302208)和抗人 CD45(hCD45) (Biolegend 目录号 304028)。
[0127] 在用IX 107个未经分级分离的脐带血细胞产生的NSG嵌合小鼠中观察到表达人 ⑶45+的T细胞和B细胞的短期发育。但是，通过与Tat-Myc和Tat-Bcl-2培养14天在体 外产生的1X106个蛋白转导长期（ptlt)-HSC的引入，导致了异种嵌合NSG小鼠中出现更 高频率的人CD45+细胞。另外，在移植后在小鼠的外周血中可观察到人CD45+细胞达20周 之久（图6A)。在异种嵌合小鼠的骨髓中发现人CD45+、CD34+CD38lciHSC (图6B)，在脾脏中 发现人⑶45+/⑶3+和人⑶45+/⑶19+淋巴样细胞，并且在胸腺中发现人⑶45+、⑶3+淋巴 样细胞。
[0128] 用CFSE标记来自异种嵌合NSG小鼠的脾脏的人⑶45+⑶19+细胞，并用抗人⑶40 和IgM的单克隆抗体活化。在72小时时通过流式细胞术分析细胞的CFSE稀释情况。图6C 显示在异种嵌合NSG小鼠体内发育的人B细胞的增殖状况。
[0129] 使用来自异种嵌合NSG小鼠的骨髓的人CD45+、0)34+0)3813(:在MethoCult Optimum中接种。这些细胞在MethoCult平板中产生集落（图6D)，并且一些集落在连续再 次平板接种后仍可观察到（图6E)。在这两种情况下，用与Tat-Myc和Tat-Bcl-2培养14 天的人脐带血细胞重构的NSG小鼠的集落数目都比从用新鲜的、未经操纵的人脐带血细胞 重构的NSG小鼠获得的细胞要显著地更高。
[0130] 另外，对一群植入了 106个之前在补加有Tat-Myc和Tat-Bcl-2的细胞因子混合 物中体外扩增的脐带血细胞的异种嵌合小鼠（黑色正方形）评估了髓样细胞和淋巴样细胞 分化。对骨髓细胞（图6F)和脾脏细胞（图6G)的CD45阳性群体分析CDllb、CD33、CD3和 CD19表达。在这些异种嵌合小鼠的骨髓和脾脏中都观察到髓样细胞和淋巴样细胞分化。 实例8 :用Tat-Mvc和Tat-Bcl-2扩增人G-CSF动员的外周血HSC [0131 ] G-CSF动员的细胞被接收在来自5名为了自体HSC移植而进行了 G-CSF动员的患 者的Iml体积的经淘洗血液中。所有G-CSF样品均去除身份标识，并且没有另外的身份标 识信息与用于这些研究的细胞相关。将细胞滴加到IOml的FCB培养基。将细胞在FCB培 养基中洗涤两次，并且用IOml体积的5 μ g/ml重组Tat-Myc和10 μ g/ml重组Tat-Bcl-2 处理。根据生产商的推荐，将细胞（5X IO6个）接种在G-Rex 100细胞扩增装置（Wilson Wolf Manufacturing)中。
[0132] 将细胞在补加有细胞因子加上Tat-Myc和Tat_Bcl2的培养基中扩增14天。扩增 的HSC的FACS谱显示hCD45+、CD34+、CD38hi、CD133+细胞的独特群体（图7A)。细胞扩增 的动力学在图7B中示出。
[0133] 然后将扩增的成人GCS-F动员的HSC接种在MethoCult Optimum上以表征它们的 体外分化潜力。获得了四种通常在支持髓类红细胞分化的培养基中观察到的集落类型（图 7C)，并且这些集落类型中的一些在连续再次平板接种时也观察到。
[0134] 扩增的成人HSC能够重构经亚致死性辐照的NSG小鼠。图7D显示12周前用106 个扩增的G-CSF和Tat-Myc/Tat-Bcl-2动员的HSC (第一小图）或5 X 106个新鲜的未经操 纵的脐带血细胞（第二小图）移植的NSG小鼠的骨髓的CD45+染色的FACS分析。
[0135] 将由用Tat-Myc和Tat-BcI-2培养的G-CSF动员细胞所产生的NSG异种嵌合小鼠 行安乐死，收集骨髓、脾脏和胸腺作进一步分析。对来自用扩增的成人HSC重构的异种嵌合 NSG小鼠的淋巴器官的分析表明，在这些小鼠的骨髓中有人⑶45+、⑶34+⑶381°细胞（图 7E ;第一小图）；在脾脏（图7E ;第二小图）和胸腺（图7E ;第三小图）中有人CD45+、CD3+ 淋巴样细胞。这些数据合在一起证明了可以成功地扩增从人G-CSF动员的成人血液获得的 HSC群体。
[0136] 对植入了 IO6个在补加有Tat-Myc和Tat-Bcl-2的细胞因子混合物中（黑色正方 形）体外扩增的G-CSF动员的细胞的一群异种嵌合小鼠评估髓样细胞和淋巴样细胞分化。 对骨髓细胞（图7F)和脾脏细胞（图7G)的CD45阳性群体分析CDllb、CD33、CD3和CD19 表达。在这些异种嵌合小鼠的骨髓和脾脏中都观察到髓样细胞和淋巴样细胞分化。另外， 源自原代异种移植物的成熟人B细胞在体外响应抗原受体的刺激，如通过流式细胞术测得 的CSFE稀释所确定（图6C)。当将从第一连续移植物发育的成熟人B细胞在体外用抗IgM 和CD40的抗体活化时，得到类似的观察结果（图8)。
[0137] 这个方法能够产生根据当前的方法移植中等体形成人（Sideri，A.， et al. (2011) .An overview of the progress on double umbilical cord blood transplantation. Hematologica 96,1213-20) (Sideri，A.等人，2011 年，"双脐带血移植进 展综述"，《血液学》，第96卷，第1213-20页））所需的足够数量的HSC。 实例9 :牛物活件Mvc融合蛋白的产牛
[0138] 除了实例1中描述的Tat-Myc融合蛋白以外，还使用本文描述的相同方法产生并 纯化了五种Myc融合蛋白。通过使用含有框内N末端PTD氨基酸序列的正向引物和移除终 止密码子的反向引物对编码区进行PCR扩增来制备质粒。然后将PCR产物克隆到pETlOl/ D-Topo (英杰公司）载体中，该载体包括C末端V5表位和6x组氨酸纯化标签。图9A显示 与实例1的Tat-Myc相比该Myc融合蛋白的示意图。在每个融合蛋白中，蛋白转导（PTD) 在Myc多肽之前或之后框内融合。
[0139] 蛋白转导结构域包括Tat、EPTD和Vpr。EPTD是经优化的蛋白转导结构域 (YARAAARQARA SEQ ID NO :6)，取自 Ho，A.等人（Synthetic protein transduction domains ：enhanced transduction potential in vitro and in vivo.Cancer Res. (2001)61 :474-477)(合成的蛋白转导结构域：在体外和体内的增强的转导潜力，《癌 症研究》，2001年，第61卷，第474-477页）。Vpr转导结构域由Taguchi，T.等人鉴定 (Nuclear trafficking of macromolecules by an oligopeptide derived from Vpr of human immunodeficiency virus type-1. Biochem. Biophys. Res. Commun. (2004)320 (I)： 18-26( "通过源自人免疫缺陷病毒I型的Vpr的寡肽进行大分子的核运输"，《生物化学与 生物物理学研究通讯》，2004年，第320卷，第1期，第18-26页））。
[0140] Myc为实例1中描述的多肽的0RF，或者为先前由Huang，Z.等人（Negative control of the Myc protein by the stress-responsive kinase Pak~2. Mol Cell Biol (2004) 24 (4) :1582-94( "胁迫响应性激酶Pak-2对Myc蛋白的负控制"，《分子细胞生 物学》，2004年，第24卷，第4期，第1582-94页））描述的3AMyc序列的0RF。该重组蛋白 还编码V5肽标签和6组氨酸标签以利于检测和纯化。（图9A)。 实例10 :活化T细朐存活测宙
[0141] 在活化T细胞存活测定中测试了实例9中描述的Myc融合蛋白（Tat-Myc、 Tat_3AMyc、EPTD-Myc、Vpr-Myc 和 Myc-Vpr)的 Myc 生物活性（图 9B)。从一只 C57BL. 6j (Jackson)小鼠收获脾脏，并通过金属丝网进行机械解离。去除红细胞，用1 μ g/ ml抗⑶3 (2cll)活化T细胞。将细胞以每孔Iml培养基中3X 10-6个细胞的密度接种到 24孔的簇培养皿（cluster dish)中。48小时后，将活细胞捕集在聚蔗糖垫层上，洗涤并以 每孔1至I. 5 X KT6个细胞的密度接种在24孔的簇培养皿中。将PTD-Myc蛋白以0. 5、1、 5、10、25或50 μ g/ml滴定到T细胞上。PTD-Myc蛋白处理后48小时，通过流式细胞术（前 向加侧向散射）评估细胞的活力。在图9B中，给出的数据是针对25 μ g/ml蛋白处理。
[0142] 如图9B中所示，除了 Tat_3AMyc以外，所有经测试的构建体在48小时后均导致比 未经处理的