30xDNA染料 10 5U/|xLDNA聚合酶 g T：otal 500
[0041] 其中口0?缓冲溶液由20〇1111化13-肥1、20〇11111((：1、10〇1111(畑4)25〇4和2〇11111拆〇4 组成。其它与【具体实施方式】一至五之一相同。
[0042] 为验证本发明的有益效果进行W下试验：
[0043] 试验1 :真核细胞模型的制备方法是按照W下步骤进行的：
[0044] -、制备单室憐脂泡囊：将二肉豆違酷憐脂酷胆碱和胆固醇加入到氯仿中，得到憐 脂溶液，将两片IT0玻璃电极表面分别涂覆5μL的憐脂溶液，待氯仿蒸干，得到两片表面覆 有憐脂溶液的ΙΤ0玻璃电极；
[0045] 将聚四氣乙締矩形框置于两片表面覆有憐脂溶液的ΙΤ0玻璃电极中间，得到电 形成装置，利用真空脂将电形成装置密封，且聚四氣乙締矩形框与两片表面覆有憐脂溶液 的ΙΤ0玻璃电极形成中间空腔，中间空腔内填充PCR缓冲溶液，在两片表面覆有憐脂溶液 的ΙΤ0玻璃电极上分别连接信号发生器，设定交流电压为5V，波形为正弦波，设定频率为 lOHz，时间控制为地，得到单室憐脂泡囊；
[0046] 二、制备人造真核细胞模型：将PCR溶液与单室憐脂泡囊混合并静置30min，得到 人造真核细胞溶液；静置时单室憐脂泡囊发生了向内凹陷的过程，维持30min目的就是让 凹陷完全；即形成大泡囊内包含两个小泡囊的脂质体；
[0047] Ξ、PCR扩增：将含有遗传物质的人造真核细胞溶液放置到PCR仪中，进行PCR扩 增；PCR扩增后的脂质体在大泡囊内存在两个小泡囊，在小泡囊内部已含有遗传物质DNA;
[0048] 四、人造细胞分裂：将PCR扩增产物与190mM的PCR缓冲溶液混合，在渗透压的作 用下，大泡囊会各自携带两个小泡囊进行分裂，最终得到真核细胞模型。
[0049] 步骤一中所述二肉豆違酷憐脂酷胆碱与胆固醇的质量比为4:1 ;
[0050] 步骤一所述憐脂溶液中二肉豆違酷憐脂酷胆碱的浓度为5mg/mL
[005。 步骤二中所述的单室憐脂泡囊与PCR溶液的体积比为1:1 ;
[0052] 步骤二中所述PCR溶液的具体成分如下：
[0053]
[0054]PCR扩增条件为：94°C预变性2min，94°C变性30s，60°C退火30s，72°C延伸70s，共 25个循环。
[00巧]使用Trizol法提取化pG2细胞的总RNA，然后反转录为cDNA，W此为模板进行PCR扩增。上游引物序列为5' -GAGAATTCATGGTGGATGAAGGCCCTGTA-3';下游引物序列为 5' -GAGGATCCGACTTTACTCCTTTGAGGCTTCA-3'。扩增出来的目的基因为iASPP基因，大小为 ll(K)bp。引物序列如序列表SEQIDN0:1所示。
[0056] 此表格中？0?缓冲溶液由20〇1111化13-肥1、20〇11111((：1、10〇1111(畑4)25〇4和2〇1111 Μ拆〇4组成。DNA染料SYBRGreenI和DNA染料缓冲溶液均购买自北京全式金生物技术有 限公司，DNA染料缓冲溶液的商品名称为TRANSTransstartTopGreenqPCRSuperMix。
[0057] PCR产物的电泳结果如图1所示，PCR扩增得到的目的片段大小为ll(K)bp，与预期 的相同。
[005引大泡囊开始分裂、分裂过程中、分裂后的照片如图2、3和4所示，从图中我们可W清楚的看到大泡囊分裂的过程。本方法最终获得的真核细胞模型照片如图5所示，可W看 出该模型是由大泡囊（模拟细胞膜）包裹着小泡囊（模拟细胞核），小泡囊中绿色巧光为遗 传物质，而大泡囊与小泡囊之间的部分没有绿色巧光，即遗传物质仅位于模拟细胞核内。 [0059] 本试验利用电形成方法制备液相为PCR缓冲溶液的单室憐脂泡囊，泡囊外通过添 加含有DNA等遗传物质的PCR溶液，在渗透压的作用下，形成结构完整，大小均一的人造真 核细胞，并且在人造细胞核中进行了PCR扩增技术及人造细胞的分裂，实现了人造细胞核 的功能化。向生命的起源和进化的研究迈出了崭新的一步。
【主权项】
1. 一种真核细胞模型的制备方法，其特征在于该方法是按照以下步骤进行的： 一、 制备单室磷脂泡囊：将二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱和胆固醇加入到氯仿中，得到磷脂溶 液，将两片ITO玻璃电极表面分别涂覆5~7μL的磷脂溶液，待氯仿蒸干，得到两片表面覆 有磷脂溶液的ΙΤΟ玻璃电极； 将聚四氟乙烯矩形框置于两片表面覆有磷脂溶液的ΙΤΟ玻璃电极中间，得到电形成装 置，利用真空脂将电形成装置密封，且聚四氟乙烯矩形框与两片表面覆有磷脂溶液的ΙΤΟ 玻璃电极形成中间空腔，中间空腔内填充PCR缓冲溶液，在两片表面覆有磷脂溶液的ΙΤΟ玻 璃电极上分别连接信号发生器，设定交流电压为3~5V，波形为正弦波，设定频率为10~ 12Hz，时间控制为1~4h，得到单室磷脂泡囊； 二、 制备人造真核细胞模型：将PCR溶液与单室磷脂泡囊混合并静置30~35min，得到 人造真核细胞溶液； 三、PCR扩增：将含有遗传物质的人造真核细胞溶液放置到PCR仪中，进行PCR扩增； 四、 人造细胞分裂：将PCR扩增产物与190mM的PCR缓冲溶液混合，最终得到真核细胞 模型。2. 根据权利要求1所述的一种真核细胞模型的制备方法，其特征在于步骤一中所述二 肉豆蔻酰磷脂酰胆碱与胆固醇的质量比为（7~4) : (3~1)。3. 根据权利要求1所述的一种真核细胞模型的制备方法，其特征在于步骤一所述磷脂 溶液中二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱的浓度为3~5mg/mL。4. 根据权利要求1所述的一种真核细胞模型的制备方法，其特征在于步骤一和步骤四 中PCR缓冲溶液由 200mMTris-HCl、200mMKCl、100mM(NH4)2S〇dP20mMMgS04组成。5. 根据权利要求1所述的一种真核细胞模型的制备方法，其特征在于步骤二中所述的 单室磷脂泡囊与PCR溶液的体积比为（1~1. 5) : 1。6. 根据权利要求1所述的一种真核细胞模型的制备方法，其特征在于步骤二中所述 PCR溶液的具体成分如下： 成分 μΙ_. ddH2〇 82 PCR缓冲溶液 邠 dNTP mix 40 上游引物 1(3 下游引物 10 DNy\模板 10 MgSOj 10 DNA染料缓冲溶液 250 50 xDNA染料 10 5U/pLDNA聚合酶 ：8 Total 500 其中PCR缓冲溶液由200mM Tris-HCl、200mM KCl、100mM(NH4)2S〇dP20mM MgS04组成。
【专利摘要】一种真核细胞模型的制备方法，涉及一种细胞模型的制备方法。本发明是要解决现有的细胞模型仅模拟了原核细胞，不满足于生命进化的研究的问题。方法：一、制备单室磷脂泡囊；二、制备人造真核细胞模型；三、PCR扩增；四、人造细胞分裂。本发明制备出结构完整，大小均一，其中的小泡囊尺寸与人体细胞核尺寸相近的人造真核细胞，并且在人造的细胞核中成功的进行了PCR技术和人造细胞的分裂过程，实现了人造细胞核的功能化。本发明用于制备真核细胞模型。
【IPC分类】C12N5/00
【公开号】CN105255809
【申请号】CN201510869545
【发明人】韩晓军, 宗薇
【申请人】哈尔滨工业大学
【公开日】2016年1月20日
【申请日】2015年12月1日