子的浓度为105个/mL)作为初始菌株进行 划线培养，挑取单菌落于新鲜的LB平板中，40°C培养4h后，lOOOOrmp离心lOmin收集菌体， 重新悬浮于无菌水中，经脱脂棉过滤后置于装有玻璃珠的小三角瓶中，振荡均匀，制备成单 细胞悬液，用光学显微镜计数后调节菌体浓度为1〇 6个/mL左右，备用；
[0089] (2)紫外诱变：将步骤（1)的5mL细胞悬浮液置于距离30w紫外灯25cm处，照射 15min；
[0090] (3)氯化理诱变：紫外照射处理后的菌液，立即放入新鲜的LB培养基中，避光培养 2h，适当稀释菌液浓度，红光下涂布于含0. 5wt%LiCl的LB平板，40°C下培养24h，记录菌 落数及计算致死率；
[0091] (4)高产菌株的筛选：向步骤⑶中诱变获得的突变株中滴入0. 02wt%的X-gal 溶液，观察菌落的显色情况，筛选菌落变深蓝的突变株，标记编号；
[0092] (5)用无菌牙签逐个点种标记的菌落于含有发酵培养基的96孔板（2mL深孔板，每 孔装液量为1200μL)，将96孔板置于摇床中培养，37°C、湿度80%、300r/min培养44h，用 酶标仪检测β-半乳糖苷酶活力，选取96孔培养板中突变值高于20 %的诱变株进行复筛；
[0093] (6)将步骤（5)挑取出来的菌株，移种于LB培养基中，培养24h，再进行96孔板高 通量验证，每株做5个平行验证，37°C发酵44h，测定酶活，挑选酶活力高的菌株作为F1代；
[0094](7)将F1中β-半乳糖苷酶活力最高的菌株重复步骤（2)~（6)，重复5次，最终 筛选出产酶能力达到50U/mL的环状芽孢杆菌突变株，产酶能力比出发菌株提高60%。
[0095] 实施例5
[0096] 按照以下步骤进行环状芽孢杆菌的高通量筛选：
[0097] (1)出发菌活化：将环状芽孢杆菌（孢子的浓度为106个/mL)作为初始菌株，进行 划线培养，挑取一环斜面菌种于新鲜的LB培养基中，37°C培养6h后，lOOOOrmp离心lOmin， 收集菌体，重新悬浮于无菌水中，经脱脂棉过滤后置于装有玻璃珠的小三角瓶中，振荡均 匀，制备成单细胞悬液，用光学显微镜计数后调节菌体浓度为1〇 6个/mL左右，备用；
[0098] (2)紫外诱变：将步骤⑴的5mL细胞悬浮液置于距离30w紫外灯25cm处，照射 20min；
[0099] (3)氯化理诱变：紫外照射处理后的菌液，冰浴2h后，放入新鲜的LB培养基中，避 光培养2h，适当稀释菌液浓度，红光下涂布于含1.Owt%LiCl的LB平板，37°C下培养24h， 记录菌落数及计算致死率；
[0100] (4)高产菌株的筛选：向步骤（3)中诱变获得的突变株中滴入0· 02wt%的X-gal 溶液，观察菌落的显色情况，筛选菌落变深蓝的突变株，标记编号；
[0101] (5)用无菌牙签逐个点种标记的菌落于含有发酵培养基的96孔板（2mL深孔板，每 孔装液量为800μL)，将96孔板置于摇床中培养，37°C、湿度80%、300r/min培养44h，用酶 标仪检测β-半乳糖苷酶活力，选取96孔培养板中突变值高于20 %的诱变株进行复筛；
[0102] (6)将步骤（5)挑取出来的菌株，移种于LB培养基中，培养24h，再进行96孔板高 通量验证，每株做5个平行验证，37°C发酵44h，测定酶活，挑选酶活力高的菌株作为F1代；
[0103] (7)将F1的菌株作为诱变亲本重复步骤（2)~(6)，重复4次，得到后代突变株分 别标记为F2、F3、F4、F5,总共经过五次紫外-氯化锂复合诱变和酶活力的重复筛选，最终筛 选出产酶能力达到48U/mL的环状芽孢杆菌突变株，产酶能力比出发菌株提高57%。
[0104] 以上实施例采用的高通量筛选方法单次可检测诱变菌株1000株以上，比常规摇 瓶育种（日处理量约40株）的效率提升25倍，是一种高效、简单的筛选方法。
[0105] 以上所述，仅为本发明的【具体实施方式】，但本发明的保护范围并不局限于此，任何 属于本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应 涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求的保护范围为准。
【主权项】
1. 一种环状芽孢杆菌的高通量筛选方法，其特征在于，包括以下步骤： (1)出发菌活化：将环状芽孢杆菌进行划线培养，挑取单菌落于新鲜的LB培养基中培 养，然后离心收集菌体，重新悬浮于无菌水中； ⑵紫外诱变：将步骤⑴细胞悬浮液用紫外灯照射； (3) 氯化理诱变：照射处理后的菌液，立即放入新鲜的LB培养基中，避光培养，并稀释 菌液浓度，红光下涂布于含LiCl的LB平板进行培养； (4) 菌株的筛选：向步骤（3)中诱变获得的突变株中滴入X-gal溶液，观察菌落的显色 情况，筛选菌落变深蓝的突变株，接种于含有培养基的96孔板； (5) 将上述96孔板置于摇床中培养，通过检测β-半乳糖苷酶活力进行筛选，得到F1 代； (6) 将F1中β-半乳糖苷酶活力最高的菌株重复步骤（2)~（5)，得到高产β-半乳 糖苷酶的环状芽孢杆菌菌株。2. 根据权利要求1所述的高通量筛选方法，其特征在于，步骤（1)所述环状芽孢杆菌的 孢子浓度为1〇5~10 8个/mL。3. 根据权利要求1所述的高通量筛选方法，其特征在于，步骤（3)所述LiCl的含量是 0. 05 ~1.Owt%。4. 根据权利要求1所述的高通量筛选方法，其特征在于，步骤（4)所述的X-gal溶液 的配制方法为：将20mgX-gal用100mL二甲基甲酰胺进行漩涡混合溶解，再用锡纸包裹避 光，置-20°C保存。5. 根据权利要求1所述的高通量筛选方法，其特征在于，步骤（4)所述96孔板为2mL 深孔板，每孔装液量为500~1200μL。6. 根据权利要求1所述的高通量筛选方法，其特征在于，步骤（4)所述培养基的组成 为：1. 2wt%的大豆蛋白胨、0. 65wt%的酵母抽提物、0. 35wt%的磷酸氢二钠、0. 25wt%的碳 酸钠、0. 55wt%的硫酸镁、1. 5wt%的乳糖和95. 50wt%的水。7. 根据权利要求1所述的高通量筛选方法，其特征在于，包括以下步骤： (1) 出发菌活化：将环状芽孢杆菌进行划线培养，挑取单菌落于新鲜的LB培养基中， 30~40°C培养4~12h后，lOOOOrmp离心lOmin收集菌体，重新悬浮于无菌水中； (2) 紫外诱变：将步骤⑴细胞悬浮液置于距离30w紫外灯25cm处，照射15~30min; (3) 氯化理诱变：照射处理后的菌液，立即放入新鲜的LB培养基中，避光培养2h，并稀 释菌液浓度，红光下涂布于含LiCl的LB平板，30~40°C下培养24h; (4) 菌株的筛选：向步骤（3)中诱变获得的突变株中滴入0. 02wt%的X-gal溶液，观察 菌落的显色情况，筛选菌落变深蓝的突变株，接种于含有培养基的96孔板； (5) 将上述96孔板置于摇床中培养，30~40°C、100~300r/min培养36~48h，通过 检测β-半乳糖苷酶活力进行筛选，得到F1代； (6) 将F1中β-半乳糖苷酶活力最高的菌株重复步骤（2)~（5)，重复2~5次，得到 高产β-半乳糖苷酶的环状芽孢杆菌菌株。
【专利摘要】本发明属于发酵工程和微生物育种的技术领域，公开了一种产β-半乳糖苷酶的环状芽孢杆菌的高通量筛选方法。主要步骤是：将初始菌株活化后，经过紫外线诱变和氯化理诱变，用96孔板进行高通量筛选，得到酶能力提高的环状芽孢杆菌突变株。本发明利用传统物理与化学相结合的诱变方式，提高菌株的突变机率，采用高通量筛选工具，减少筛选工作量，提高筛选效率，加快菌种选育的进程，筛选出最佳菌株。
【IPC分类】C12N15/01, C12N13/00, C12R1/09
【公开号】CN105274086
【申请号】CN201510681503
【发明人】曾宪经, 邓宝浣, 陈振鹏, 阮鸿波, 陈子健
【申请人】量子高科(中国)生物股份有限公司
【公开日】2016年1月27日
【申请日】2015年10月19日