因rs1034794位点附近序列的上游引物和下游引物，其中 上游引物具有错配碱基A以获得含AGCW片段的扩增产物，其中W为人P0T1基因rsl034794 位点上的待定碱基A或T;以及
[0031] 仅能够切开AGCA片段与AGCT片段之一的限制性内切酶。
[0032] 上述试剂盒中还可以包括其它成分，例如PCR反应Mix(主要包括dNTPs，Mg2+，Taq DNApolymerase,TaqAntibody等）和用于实施测定的说明书等。
[0033] 本领域技术人员可以理解，除非有明显抵触，本发明的第一方面和第二方面的相 关特征可以相互组合。
[0034] 本发明的测定手段不但快速可靠，而且测定成本大大降低。
【附图说明】
[0035]图1描述了根据本发明的方法获得的酶切产物电泳紫外照片。其中Marker是：标 准参考位置；泳道1 :TT型测试结果；泳道2 :AT混合型测试结果；泳道3 :AA型测试结果。
【具体实施方式】
[0036] 下面对本发明进行详细描述。本领域技术人员应当理解，以下详细描述仅用于说 明而非限定本发明。
[0037] (1)待测DNA的获取
[0038] 采集不同人群外周血，提取基因组DNA后进行下面的P0T1基因rsl034794位点多 态性的测定。
[0039] 对于待测DNA的选择，本发明并没有特别的限制。既可以是从人体的体液或者组 织获得离体样本，还可以是经过预先降解处理的基因组。为了方便实施，通常优选从血液提 取离体样本。其中所述的组织包括人体中含有全部或至少P0T1基因的组织，而与是否表达 该P0T1基因无关。从体液和/或组织中提取DNA的方法是本领域技术人员公知的，并且可 以参考常用的分子生物学手册，例如《分子克隆》第2版进行。
[0040] ⑵引物设计与合成
[0041] 查找NCBI网站的Gene数据库和SNP数据库，分别获得P0T1基因全序列和 rsl034794多态位点信息。
[0042]rsl034794多态位点W前后部分碱基序列（碱基序列以5' 一 3'表示，大小写意 义相同）如下（SEQIDNO:1):
[0045] 根据基因序列进行上游引物和下游引物设计，其中，上游引物引入错配碱基。在最 终所得扩增产物上，上游引物的错配碱基A与W之间相隔两个碱基GC。
[0046] 在本发明中，上游引物具有错配碱基A，且长度为35~60bp。其中一个实施例中， 引物如下，上游引物：5'ATCTGITTAACATGCAAGAATTATATTCAAACTTCAGGATCAAGC3'（SEQ IDN0:2)，下游引物：5'GATGGAATAGACCTAGAGCAA3'（SEQIDN0:3)，其中上游引物下划 线碱基为错配碱基。
[0047] (3)制备PCR扩增产物
[0048] 根据上游引物和下游引物特征及PCR相应试剂制定PCR扩增程序和条件，制备PCR 扩增产物。其中一个实施例中，取基因组DNA(50~80ng)、上下游引物（终浓度为0. 1~ 1μΜ)、2XPCR Mix7. 5μL(包括4种dNTP混合物、Taq DNA polymerase、Taq Antibody、 Mg2+、缓冲液，DMSO和硫酸铵）和双蒸水共同组成15μL反应体系，调整溶液pH为7. 3左右。 PCR反应条件为：95°C预变性30s，95°C变性30s- 65°C退火30s- 72°C延伸20s共30个 循环，72°C延伸7min。PCR反应后获得稳定的扩增产物。
[0049] ⑷酶切反应
[0050] 本发明可以采用Alul内切酶或者CviKI-Ι内切酶，多数内切酶比多态位点附近碱 基无错配情况下可采用的HpyCH4V内切酶要便宜，如表1所示。
[0051] 表1NEB公司几种内切酶识别序列及其价格
[0052]
[0053] 注：R为A或G;Y为C或T。
[0054] 其中一个实施例中，取PCR产物10yL，加入5U内切酶AluI、2yL10Χ酶切缓冲 液和7. 5μL双蒸水组成20μL反应体系，37°C水浴中酶切4~12h，即得酶切产物，酶切产 物经1倍浓缩后电泳观察。
[0055] (5)电泳测试
[0056] 其中一个实施例中，PCR产物经Alul酶切后如果不能切开则仍为196bp，如果被切 开则出现152bp和44bp，其中44bp片段电泳图中难以分辨。
[0057] 将酶切产物在2~4%琼脂糖凝胶中3~8V/cm条件下，电泳30~80min，于紫外 灯下拍照测定。酶切电泳见图1，依据196bp和152bp片段的有无判断来判断基因型：AA型 为196bp-个片段，AT型有196bp、152bp片段，TT型为152bp-个片段。
[0058] 下面是实施本发明的若干实施例。
[0059] 实施例1提取人外周血白细胞DNA测定rsl034794多态性
[0060] 1材料与方法
[0061] 1.1主要试剂及仪器
[0062]试剂：2XPCRMix(包括 4 种dNTP混合物、TaqDNApolymerase、TaqAntibody、 Mg2+、缓冲液，DMSO和硫酸铵），限制性内切酶Alul(NEB公司），琼脂糖（Biowest公司），引 物由上海Sangon公司合成。
[0063]仪器：9600 型PCR仪（PE公司），微型电泳槽（Pharmacia Biotech, EPS1000)，Gel Doc2000凝胶成像仪（Bio-RAD公司）。
[0064] 1. 2从外周血白细胞中提取DNA作为待测基因组DNA模板
[0065] EDTA_K2抗凝管采集人外周血lmL，参考《实用流式细胞术彩色图谱》中白细胞的分 离方法进行白细胞分离，参考《分子克隆》中氯化钠盐析法提取白细胞基因组DNA，并作为待 测人基因组DNA模板。1.3序列查找及引物设计
[0066] 在NCBI网站查找P0T1基因序列和rsl034794多态位点信息来设计引物，具体如 下：
[0067]上游引物：5'ATCTGTTTAACATGCAAGAATTATATTCAAACTTCAGGATCAAGC3'（SEQID NO:2)；
[0068]下游引物：5'GATGGAATAGACCTAGAGCAA3'（SEQIDN0:3)
[0069] 1.4PCR扩增
[0070] 取基因组DNA(50~80ng)、上下游引物（终浓度为0· 1~1yM)、2XPCRMix 7.5以1^(包括4种(11^1：)混合物、1&9〇嫩。〇15〇116抑86、1&9 4111:;[130(17、]\%2+、缓冲液，〇]\130和 硫酸铵），灭菌双蒸水补足15μL反应体系，调整溶液pH为7. 3左右。
[0071] ?0?反应条件为：95°(：预变性3〇8,95°(：变性3〇8 - 65°(：退火3〇8 - 72°(：延伸2〇8 共30个循环，72°C延伸7min。PCR反应后获得稳定的扩增产物。
[0072] 1. 5酶切鉴定
[0073]PCR扩增后，取PCR产物10μ1，加入5U内切酶Α1ιιΙ、2μ1 10X酶切缓冲液和灭 菌双蒸水组成20μ1反应体系，37 °C水浴中酶切4h，即得酶切产物。
[0074] 上述酶切产物经1倍浓缩后，在3%琼脂糖凝胶5V/cm条件下，电泳40min，于紫外 灯下拍照鉴定多态类型。
[0075] 2结果
[0076] 2. 1PCR扩增结果
[0077]扩增后序列（其位于SEQIDNO: 1碱基序列中456-651处，共196bp)，所获得的扩 增产物序列如下（SEQIDNO:4):
[0078]
[0079] 扩增后产物序列中下划线部分分别为上游、下游引物所对应的序列，W代表A/T多 态即SNP位点rs1034794。
[0080] 2. 2酶切结果
[0081] 经内切酶Alul酶切后的产物序列分别如下：
[0082] 该多态位点含有T等位基因时PCR产物酶切后可形成切开片段152bp序列（SEQ IDNO：5)：
[0083]
[0084] 该多态位点含有T等位基因时PCR产物酶切后可形成切开片段44bp序列（SEQID NO：6)：
[0085] atctgtttaa catgcaagaa ttatattcaa acttcaggat caag 44
[0086] 酶切产物电泳后于紫外灯下拍照鉴定，结果示于图1中。其中，rsl034794位点扩 增后出现196bp片断，经Alul酶切后出现196bp、152bp、44bp三种片段（其中44bp在电泳 图中不易分辨）。
[0087] 酶切后基因型判断：如图1所示，酶切后基因型判断：TT型为152bp-个片段，AT 型有152bp和196bp两种片段，AA型为196bp-个片段。
[0088] 2· 3P0T1基因rsl034794位点多态结果
[0089] 共检测88例人员，检测结果发现rs1034794位点出现CC型20例、AC型46例和 AA型22例。
[0090] 实施例2人外周血全血标本测定rsl034794多态性
[0091]主要试剂及仪器同实施例1。参考《分子克隆技术》中酚-氯仿抽提法提取外周血 基因组DNA，并作为待测人基因组DNA模板。
[0092] 序列查找同实施例1，设计引物序列如下：
[0093]上游引物：5'TCTGTTTAACATGCAAGAATTATATTCAAACTTCAGGATCAAG3'（SEQID NO:7)；
[0094]下游引物：5'TGTATATCATAGATGGAATAGACCT3'（SEQIDN0:8)
[0095] 取基因组DNA(50~80ng)、上下游引物（终浓度为0· 1~1 yM)、2XPCR Mix 10 μ L(包括4种dNTP混合物、Taq DNA polymeras