表面.(b)通过多次可见光弓I发可控活性接枝交联聚合原位包埋不同的酶于不同的网布层之中。
【具体实施方式】
[0031]下面结合实施例对本发明作详细说明，但并不构成对本发明的限制。
[0032]实施例1:
[0033]将40 μ L, 3mmol/mL的异丙基硫杂蒽酮丙酮溶液均勾地涂覆在3 X 3cm2低密度聚乙烯膜的一侧，然后将涂覆有溶液的膜置于两片石英片之间，随后将此体系置于高压汞灯(波长254nm，9mW/cm2)下在室温下照射3分钟。紫外辐照完毕后，使用丙酮对低密度聚乙烯膜抽提24小时，室温下晾干。
[0034]将一定量的胰蛋白酶溶解于0.1M的Tris-HCl (pH = 7.0)缓冲液中，震荡溶解，形成11.5mg/mL的胰蛋白酶溶液，将此溶液与聚乙二醇二丙烯酸酯按照75:45(v/v)进行混合后，取60 μ L涂敷在接枝有异丙基硫杂蒽酮的低密度聚乙烯膜一侧，然后将涂覆有溶液的膜置于两片带有图案化透光区域的掩膜之间，随后将此体系置于氙灯(波长420nm，3mff/cm2)下照射30分钟。可见光辐照完毕后，将膜浸泡在0.1M的Tris-HCl (pH = 7.0)缓冲液中浸泡24小时，之后用大量缓冲液对膜进行冲洗以去除未固定的胰蛋白酶。
[0035]将一定量的谷氨酰胺转移酶溶解于0.1M的Tris-HCl (pH = 7.0)缓冲液中，震荡溶解，形成3.5mg/mL的谷氨酰胺转移酶溶液，将此溶液与聚乙二醇二丙烯酸酯按照75:45 (v/v)进行混合后，取60 μ L涂敷在接枝有包埋有胰蛋白酶网布层的低密度聚乙烯膜上，然后将涂覆有溶液的膜置于两片掩膜之间，随后将此体系置于氙灯(波长420nm，3mW/cm2)下照射30分钟。可见光辐照完毕后，将膜浸泡在0.1M的Tris-HCl (pH = 7.0)缓冲液中浸泡24小时，之后用大量缓冲液对膜进行冲洗以去除未固定的谷氨酰胺转移酶。
[0036]以N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯(BAEE)为底物对胰蛋白酶酶活进行测试，取面积为3 X 3cm2的双酶包埋膜置于1mL酶活测定底物溶液中(10mM Tris-HCl缓冲液(pH = 8.0),ImM BAEE, 1mM CaCl2)，于35°C下震荡反应4分钟，每0.5分钟使用紫外可见分光光度计测量溶液在253nm下的吸光度，胰蛋白酶的BAEE单位定义为:以BAEE为底物，在一定反应条件下，每分钟使Λ A253nm增加0.001的酶量为一个BAEE单位。经此种方法测定，双酶包埋膜中胰蛋白酶的酶活为7051Units/mg。
[0037]以Na-CBZ-Gln-Gly为底物对谷氨酰胺转移酶酶活进行测试，取面积为3X 3cm2的双酶包埋膜置于6mL酶活测定底物溶液中(10mM Tris-HCl缓冲液(pH = 6.0)，30mMNa-CBZ-Gln-Gly, 1mM谷胱甘肽，5mM CaCl2)，于35°C下震荡反应5分钟，反应结束后立即加入3mL终止试剂(3mol/L的HCl，TCA质量分数为1.2%的水溶液，FeCl3质量分数为5%的水溶液按1:1:l(v/v)混合)，使用紫外可见分光光度计测量溶液在525nm下的吸光度，I个单位谷氨酰胺转移酶酶活定义为:在上述条件下每分钟催化形成Iymol L-谷氨酸-γ单羟胺酸的酶量。经此种方法测定，双酶包埋膜中谷氨酰胺转移酶的酶活为1228Units/mg。
[0038]将测完酶活的双酶包埋膜取出后使用大量0.1M的Tris-HCl (pH = 7.0)缓冲液冲洗后进行下一批次的酶活测试实验以检测双酶包埋膜的操作稳定性。经测定，双酶包埋膜在使用4个批次以后，两种酶的酶活力都没有发生明显的下降。
[0039]对比实施例1:
[0040]首先将11.5mg/mL的胰蛋白酶溶液与3.5mg/mL的谷氨酰胺转移酶溶液混合均匀后，再将此溶液与聚乙二醇二丙烯酸酯按照75:45(v/v)进行混合，取60 μ L涂敷在接枝有异丙基硫杂蒽酮的低密度聚乙烯膜一侧，然后将涂覆有溶液的膜置于两片石英片之间，随后将此体系置于氙灯(波长420nm，3mW/cm2)下照射30分钟。可见光辐照完毕后，将膜浸泡在0.1M的Tris-HCl (pH = 7.0)缓冲液中浸泡24小时，之后用大量缓冲液对膜进行冲洗以去除未固定的胰蛋白酶和谷氨酰胺转移酶。
[0041]酶活测定方法同实施例1。经测定，混合包埋的酶膜中胰蛋白酶的酶活为5986Units/mg，谷氨酰胺转移酶的酶活为244Units/mg。造成酶活降低的原因在于:胰蛋白酶是一种可以将蛋白质和多肽进行水解的酶，由于大多数酶本身是由蛋白质组成，将蛋白酶与其他酶进行混合时会造成其他酶的分解而导致失活。谷氨酰胺转移酶就是一种由蛋白质组成的酶，它的作用是将多肽链上赖氨酸的氨基与谷氨酰胺的氨基相互交联，如若将谷氨酰胺转移酶与胰蛋白酶混合使用，在胰蛋白酶分解谷氨酰胺转移酶的同时，谷氨酰胺转移酶也会使胰蛋白酶发生交联而影响胰蛋白酶的活性。
[0042]实施例2:
[0043]将600 μ L, 5mmol/mL的异丙基硫杂蒽酮丙酮溶液均勾地涂覆在3 X 3cm2聚丙稀无纺布的一侧，然后将涂覆有溶液的无纺布置于两片石英片之间，随后将此体系置于高压汞灯(光强为5mW/cm2)下在室温下照射5分钟。紫外辐照完毕后，使用丙酮对无纺布抽提24小时，室温下晾干。
[0044]将一定量的木瓜蛋白酶溶解于0.1M的Tris-HCl (pH = 7.0)缓冲液中，震荡溶解，形成10mg/mL的木瓜蛋白酶溶液，将此溶液与聚乙二醇双甲基丙烯酸酯按照1:1 (v/v)进行混合后，取800 μ L涂敷在接枝有异丙基硫杂蒽酮的无纺布一侧，然后将涂覆有溶液的无纺布置于两片石英片之间，随后将此体系置于LED灯(光强为0.5mff/cm2)下照射90分钟。可见光辐照完毕后，将膜浸泡在0.5M的Tris-HCl (pH = 7.0)缓冲液中浸泡24小时，之后用大量缓冲液对无纺布进行冲洗以去除未固定的木瓜蛋白酶。
[0045]将一定量的脂肪酶溶解于0.5M的Tris-HCl (pH = 7.0)缓冲液中，震荡溶解，形成8.5mg/mL的脂肪酶溶液，将此溶液与聚乙二醇双甲基丙烯酸酯按照1:1 (v/v)进行混合后，取800 μ L涂敷在包埋有木瓜蛋白酶网布层的无纺布上，然后将涂覆有溶液的无纺布置于两片石英片之间，随后将此体系置于LED灯(光强为0.5mW/cm2)下照射90分钟。可见光辐照完毕后，将膜浸泡在0.5M的Tris-HCl (pH = 7.0)缓冲液中浸泡24小时，之后用大量缓冲液对无纺布进行冲洗以去除未固定的脂肪酶。
[0046]将一定量的β -葡萄糖苷酶溶解于0.5Μ的Tris-HCl (pH = 7.0)缓冲液中，震荡溶解，形成5.5mg/mL的β -葡萄糖苷酶溶液，将此溶液与聚乙二醇双甲基丙烯酸酯按照I: I (v/v)进行混合后，取800 μ L涂敷在包埋有脂肪酶网布层的无纺布上，然后将涂覆有溶液的无纺布置于两片石英片之间，随后将此体系置于LED灯(光强为0.5mff/cm2)下照射90分钟。可见光辐照完毕后，将膜浸泡在0.5M的Tris-HCl (pH= 7.0)缓冲液中浸泡24小时，之后用大量缓冲液对无纺布进行冲洗以去除未固定的β-葡萄糖苷酶。
[0047]以N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯(BAEE)为底物对木瓜蛋白酶酶活进行测试，取面积为3Χ3cm2的三酶包埋膜置于1mL酶活测定底物溶液中(10mM Tris-HCl缓冲液(pH =8.0)，ImM BAEE, 1mM CaCl2)，于35°C下震荡反应4分钟，每0.5分钟使用紫外可见分光光度计测量溶液在253nm下的吸光度，木瓜蛋白酶的BAEE单位定义为:以BAEE为底物，在一定反应条件下，每分钟使Λ A253nm增加0.001的酶量为一个BAEE单位。经此种方法测定，三酶包埋膜中木瓜蛋白酶的酶活为2045Units/mg。与单独包埋相比，酶活保持率在89%以上。
[0048]脂肪酶活力单位定义:以对硝基苯酚棕榈酸酯(p-NPP)为底物，在37°C下，每分钟释放出I μ moL对硝基苯酸所需酶的量定义为一个脂肪酶活力单位(U) c^p-NPP在波长405nm下的紫外吸收远远弱于对硝基苯酚。在脂肪酶的催化下，随着酯键的水解，对硝基苯酚逐渐增多，反应体系的紫外吸收随之相应增