下照射30分钟。可见光辐照完毕后，将膜浸泡在0.1M的Tris-HCl (pH =7.0)缓冲液中浸泡24小时，之后用大量缓冲液对膜进行冲洗以去除未固定的胰蛋白酶和谷氨酰胺转移酶。
[0069]酶活测定方法同实施例1。经测定，双酶包埋膜中胰蛋白酶的酶活为8461Units/mg,双酶包埋膜中谷氨酰胺转移酶的酶活为1326Units/mg。
[0070]实施例7:
[0071]将300 μ L,0.6mmol/mL的异丙基硫杂蒽酮丙酮溶液均勾地涂覆在4X 3cm2聚对苯二甲酸乙二醇酯薄膜的两侧，然后将涂覆有溶液的聚对苯二甲酸乙二醇酯薄膜置于两片石英片之间，随后将此体系置于高压汞灯(光强为2mW/cm2)下在室温下照射5分钟。紫外辐照完毕后，使用丙酮对聚对苯二甲酸乙二醇酯薄膜抽提48小时，室温下晾干。
[0072]首先将12mg/mL的木瓜蛋白酶溶液与聚乙二醇二丙稀酸酯按照75:45 (v/v)进行混合后，取90 μ L涂敷在接枝有异丙基硫杂蒽酮的聚对苯二甲酸乙二醇酯薄膜的一侧，将5mg/mL的谷氨酰胺转移酶溶液与亚甲基双丙烯酰胺按照75:45 (v/v)进行混合后，取90 μ L涂敷在膜的另一侧，然后将涂覆有溶液的膜置于两片带有图案化透光区域的掩膜之间，随后将此体系置于氙灯(波长420nm，3mW/cm2)下照射50分钟。可见光辐照完毕后，将膜浸泡在0.1M的Tris-HCl (pH = 7.0)缓冲液中浸泡24小时，之后用大量缓冲液对膜进行冲洗以去除未固定的木瓜蛋白酶和谷氨酰胺转移酶。
[0073]酶活测定方法同实施例1。经测定，双酶包埋膜中木瓜蛋白酶的酶活为1835Units/mg，双酶包埋膜中谷氨酰胺转移酶的酶活为1474Units/mg。
[0074]实施例8:
[0075]将500 μ L，0.5mmol/mL的异丙基硫杂蒽酮丙酮溶液均勾地涂覆在2 X 3cm2聚对聚乳酸膜的两侧，然后将涂覆有溶液的聚乳酸膜置于两片石英片之间，随后将此体系置于高压汞灯(光强为2mW/cm2)下在室温下照射5分钟。紫外辐照完毕后，使用丙酮对聚乳酸膜抽提48小时，室温下晾干。
[0076]首先将10mg/mL的木瓜蛋白酶溶液与聚乙二醇双甲基丙稀酸酯按照1:1 (v/v)进行混合后，取100 μ L涂敷在接枝有异丙基硫杂蒽酮的聚乳酸膜一侧，将10mg/mL的脂肪酶溶液与聚乙二醇双甲基丙烯酸酯按照1:1 (v/v)进行混合后，取100 μ L涂敷在膜的另一侧，然后将涂覆有溶液的聚乳酸膜置于两片石英片之间，随后将此体系置于LED灯(光强为
0.5mff/cm2)下照射100分钟。可见光辐照完毕后，将膜浸泡在0.5M的Tris-HCl (pH = 7.5)缓冲液中浸泡48小时，之后用大量缓冲液对膜进行冲洗以去除未固定的木瓜蛋白酶和脂肪酶。
[0077]酶活测定方法同实施例2。经测定，双酶包埋膜中木瓜蛋白酶的酶活为2258Units/mg，双酶包埋膜中脂肪酶的酶活为1.36U。
[0078]实施例9:
[0079]将lmL，2.5mmol/mL的异丙基硫杂蒽酮丙酮溶液均勾地涂覆在3X3cm2尼龙布的两侧，然后将涂覆有溶液的尼龙布置于两片石英片之间，随后将此体系置于高压汞灯(光强为2mW/cm2)下在室温下照射5分钟。紫外辐照完毕后，使用丙酮对尼龙布抽提48小时，室温下晾干。
[0080]首先将20mg/mL的葡萄糖氧化酶溶液与聚乙二醇二丙烯酸酯按照1:2 (v/v)进行混合后，取800 μ L涂敷在接枝有异丙基硫杂蒽酮的尼龙布一侧，将15mg/mL的辣根过氧化物酶溶液与亚甲基双丙烯酰胺按照l:2(v/v)进行混合后，取800 μ L涂敷在膜的另一侧，然后将涂覆有溶液的尼龙布置于两片石英片之间，随后将此体系置于氙灯(光强为1.5mW/cm2)下照射60分钟。可见光辐照完毕后，将膜浸泡在0.3M的Tris-HCl (pH = 7.2)缓冲液中浸泡72小时，之后用大量缓冲液对固定有酶的尼龙布进行冲洗以去除未固定的两种酶。
[0081]酶活测定方法同实施例3。经测定，双酶包埋膜中葡萄糖氧化酶的酶活为1135Units/mg，双酶包埋膜中辣根过氧化物酶的酶活为521Units/mg。
【主权项】
1.一种分隔固定多种酶的方法，其特征在于包括以下步骤: (1)将异丙基硫杂蒽酮的丙酮溶液均匀地涂覆在聚合物膜的一侧，然后将涂覆有异丙基硫杂蒽酮的丙酮溶液的膜置于两片石英片之间，随后将此体系置于汞灯下室温照射1-5分钟，光强为0.9mff/cm2-9mff/cm2,引入表面可见光休眠基； (2)将含有游离酶A的单体可聚合溶液涂敷在接枝有异丙基硫杂蒽酮的聚合物膜一侦牝然后将涂覆有溶液的膜置于两片透光片之间，随后将此体系置于可见光灯下室温照射20-180分钟，光强为0.3mff/cm2-3mff/cm2,对酶A进行网布固定； (3)将含有游离酶B的单体可聚合溶液涂敷在包埋有酶A的网布层之上，然后将涂覆有溶液的膜置于两片透光片之间，随后将此体系置于可见光灯下室温照射20-180分钟，光强为0.3mW/cm2-3mW/cm2，在酶A网布层上对酶B进行网布固定。2.根据权利要求1所述的分隔固定多种酶的方法，其特征在于:步骤(1)中所述异丙基硫杂蒽酮的丙酮溶液浓度为0.5-4M。3.根据权利要求1所述的分隔固定多种酶的方法，其特征在于:步骤(1)中所使用的聚合物膜为聚合物片材、多孔膜、纺织品或非织造织物。4.根据权利要求1所述的分隔固定多种酶的方法，其特征在于:步骤(2)和(3)中所述的单体为聚乙二醇二丙烯酸酯，聚乙二醇双甲基丙烯酸酯或亚甲基双丙烯酰胺。5.根据权利要求1所述的分隔固定多种酶的方法，其特征在于:步骤(2)和(3)中所述的透光片为石英片或带有可透光图案化的掩膜。6.根据权利要求1所述的分隔固定多种酶的方法，其特征在于:步骤(2)和(3)中所述的可见光灯为氙灯或LED灯。7.根据权利要求1所述的分隔固定多种酶的方法，其特征在于:步骤(2)和(3)中所述单体可聚合溶液组成如下:酶质量百分含量为0.01% -20%，可聚合单体的质量百分含量为20% -60%，余量为水或pH范围为4-9的缓冲溶液。8.根据权利要求1所述的分隔固定多种酶的方法，其特征在于包括以下步骤:将异丙基硫杂蒽酮的丙酮溶液均匀地涂覆在聚合物膜的两侧，然后将涂覆有异丙基硫杂蒽酮的丙酮溶液的膜置于两片石英片之间，随后将此体系置于汞灯下室温照射1-5分钟，光强为0.9mW/Cm2-9mW/Cm2，膜正反面皆引入表面可见光休眠基；之后将酶A的可聚合溶液涂覆在聚合物膜的一侧，将酶B的可聚合溶液涂覆在膜的另一侧，随后将此体系置于可见光灯下室温照射20-180分钟，对酶A酶B进行分隔固定。9.根据权利要求1所述的分隔固定多种酶的方法，其特征在于还包括以下步骤: 将含有游离酶C的单体可聚合溶液涂敷在包埋有酶B的网布层之上，然后将涂覆有溶液的膜置于两片透光片之间，随后将此体系置于可见光灯下室温照射20-180分钟，光强0.3mW/cm2-3mW/cm2在酶B网布层上对酶C进行网布固定。10.根据权利要求9中所述的分隔固定多种酶的方法，其特征在于还包括以下步骤: 在包埋有酶C的网布层之上进一步分层固定不同种类酶。
【专利摘要】一种分隔固定多种酶的方法，属于固定化酶制备领域。本发明分为以下步骤：首先将酶A原位包埋固定在聚合物基材表面的三维网络之中；之后在可见光的照射下，固定有酶A的三维网络层表面的光感应休眠种重新产生表面自由基，引发混合有酶B的单体溶液进行二次活性接枝交联聚合，将酶B原位包埋固定在第一层表面的三维网络之中，形成第二层交联网络；重复上述步骤，可将不同的酶分别包埋在更多的网络层之中。固定化过程中可以保存大部分酶的活性。将不同的酶分开固定在不同的网络层之中，既可以避免相互干扰抑制，又可以共同完成一个复杂的化学反应。聚合物基材可以提高复合膜的机械强度，增强了酶膜的稳定性，更有利于酶膜的回收再利用。
【IPC分类】C12N11/08, C12N11/18
【公开号】CN105296462
【申请号】CN201510812888
【发明人】杨万泰, 朱兴, 赵长稳, 马育红
【申请人】北京化工大学
【公开日】2016年2月3日
【申请日】2015年11月22日