绿原酸样品和％在0. 1-0. 4mg/mL范 围内时，其总抗氧化能力与浓度呈正相关关系。从上述图中可以看出，在同一浓度时，只有 绿原酸II的总抗氧化能力高于V e总抗氧化能力。
[0138] (2)清除羟基自由基（· 0H)能力
[0139] 绿原酸清除羟基自由基（· 0H)能力结果如附图19所示，葵花籽柏绿原酸和％在 0-0· 2mg/mL范围内，绿原酸I在0-0· 8mg/mL范围内时，其清除羟基自由基（· 0H)能力随 着浓度的增加而增强，但是粗绿原酸样品〇-〇. 8mg/mL范围内时，其基本对羟自由基无明显 清除作用。由图19可知，且在同一浓度时，绿原酸II的清除羟基自由基（·0Η)能力略高 于V e;V ￡的IC 5。值为0. 061mg/mL，绿原酸II的IC 5。值为0. 029mg/mL，绿原酸I的IC 5。值为 0· 459mg/mL。绿原酸I清除羟基自由基（· 0H)能力比Vc^g 6. 5倍，绿原酸II清除羟基自 由基（· 0H)能力比乂。高110. 34%。
[0140] (3) DPPH ·自由基清除能力
[0141] 绿原酸DPPH ·自由基清除能力结果如附图20所示，绿原酸样品和Vc在0-0.1 mg/ mL范围内时，其DPPH ·自由基清除能力随着浓度的增加而增强，到0. 2mg/mL时基本稳定。 可知，同一浓度时，绿原酸II样品DPPH ·自由基清除能力明显高于Vc，绿原酸I的DPPH ·自 由基清除能力和Ve相当。V ￡的IC 5。值为0. 061mg/mL，绿原酸II的IC 5。值为0. 052mg/mL，绿 原酸I的IC5。值为0. 058mg/mL，粗绿原酸的IC5。值为0. 097mg/mL。绿原酸I、绿原酸II清 除DPPH ·自由基能力比Vc*别高4. 92%、17. 75%。
[0142] 综上所述，大孔树脂-溶致结晶联用纯化技术的应用对提高绿原酸体外抗氧化活 性作用显著。
[0143] 2、葵花籽柏绿原酸抑菌性结果
[0144] (1)葵花籽柏绿原酸对实验菌株生长的影响
[0145] 以大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、黑曲霉为实验菌株，测定抑菌圈直径大小，研究纯 化的葵花籽柏绿原酸样品对实验菌株生长的影响。其结果如表6所示。
[0146] 表6葵花籽柏绿原酸抑菌实验结果
[0148] 由表6可以看出葵花籽柏绿原酸对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、黑曲霉均有一定 的抑菌作用。且从抑菌圈的大小中可以看出，葵花籽柏绿原酸的抑菌能力强于绿原酸I，绿 原酸I、绿原酸II对上述三种菌的抑菌能力大小为：大肠杆菌、黑曲霉、金黄色葡萄球菌。
[0149] (2)最小抑菌浓度（MIC)和最小杀菌浓度（MBC)
[0150] 表7葵花籽柏绿原酸抑菌实验结果
[0153] 从表7中可以看出，绿原酸II的抑菌能力强于绿原酸I，绿原酸I对大肠杆菌、金 黄色葡萄球菌、黑曲霉的MIC、MBC的浓度分别为3. 5、3. 5、3. 0,3. 5、3. 5、3. Omg/mL ;葵花 籽柏绿原酸对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、黑曲霉的MIC、MBC的浓度分别为1. 2、1. 5、1. 2， L 2、L 5、L 5mg/mL〇
[0154] 3、葵花籽柏绿原酸对匍枝根霉的抑制作用试验
[0155] (1)不同浓度的绿原酸对根霉孢子萌发的影响
[0156] 由附图21可以看出，绿原酸对根霉孢子的萌发具有明显的抑制作用，且浓度越 大，抑制效果越显著；第一天空白组孢子数为125个，而1.8mg/mL的培养皿仅有孢子数22 个。当浓度为I. 8mg/mL时，抑制孢子萌发的程度可达82. 4%。
[0157] (2)不同浓度的绿原酸对根霉菌落形态的影响
[0158] 绿原酸不仅对根霉孢子的萌发具有抑制作用，而且影响根霉早期菌落的形态和大 小，用肉眼及放大镜观察发现，根霉孢子萌发具有显著的时间效应：随绿原酸浓度增加，孢 子萌发速度减慢；当绿原酸浓度为〇. 6-0. 9mg/mL时，根霉早期菌落明显较小，而且由近圆 形开始变成不规则形状，且逐渐裂解；当浓度达到1.8mg/mL时抑制作用更明显，几乎无早 期菌落长出，随培养时间延长，各浓度下均有菌落长出。见图22知，随绿原酸浓度增加，菌 落直径均在逐渐减小，根霉菌落的颜色逐渐由白色变成黑色。说明，绿原酸抑制根霉菌丝生 长并加速其老化衰退，浓度越大，抑制作用越强。
[0159] (3)不同浓度的绿原酸对根霉菌丝生长的影响
[0160] 表8绿原酸对根霉菌丝直径影响的时效性
[0161]
[0162] 由表8和图22可看出随着绿原酸浓度的增加，匍枝根霉的菌丝逐渐变细而弯曲； 孢子囊的体积逐渐变小，囊中的孢子数量明显减少。浓度越大菌丝生长越慢，不加绿原酸组 第6天菌丝直径已达9. 5 μ m，而I. 8mg/mL绿原酸组第6天为5. 8 μ m。
[0163] 4、葵花籽柏绿原酸对面包贮藏期的影响
[0164] 根据GB7099-2003《糕点、面包卫生标准》规定，热加工面包菌落总数不得超过 1500cfu/g。对照组为不添加绿原酸制备的面包，试验组为添加本发明制备的葵花籽柏绿原 酸制备的面包。
[0165] 由图23可知，对照组的菌落总数变化迅速，在三天后已不符合国标，试验组在四 天后不符标准。对照组在第六天表面已出现肉眼可见的菌落；菌落总数为9X106cfu/g ;试 验组在第八天出现腐败。绿原酸使面包的贮藏期延长了 33. 3%，且第六天实验组的菌落总 数为I. 5X104cfu/g。可见绿原酸在面包贮藏中起到了重要的作用。
[0166] 葵花籽柏绿原酸对发霉面包中匍枝根霉的抑制作用以及在面包贮藏中的应用，研 究表明葵花籽柏绿原酸对大肠杆菌的抑制作用最强；以发霉面包上的匍枝根霉为研究对 象，当葵花籽柏绿原酸浓度为I. 8mg/mL时，82. 4%的匍枝根霉孢子不能萌发，葵花籽柏绿 原酸对匍枝根霉有显著的抑制作用；将葵花籽柏绿原酸添加到面包中，可以使面包的贮藏 期延长33. 3%，葵花籽柏绿原酸可以作为面包的天然防腐剂。
[0167] 实施例五：葵花籽柏绿原酸提取效果比较
[0168] 表9三种提取方法提取葵花籽柏绿原酸提取效果比较
[0170] 由表9可知，三种葵花籽柏绿原酸提取方法中，超声辅助离子液体提取得率明显 高于其它两种，比传统提取法、超声辅助提取法分别高出28. 25%、17. 21%。
[0171] 如上所述，即可较好地实现本发明，上述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方 式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普 通技术人员对本发明的技术方案作出的各种变形和改进，均应落入本发明确定的保护范围 内。
【主权项】
1. 一种葵花籽柏绿原酸的制备方法，其特征在于，所述的制备方法具体步骤如下： (1) 葵花籽柏的预处理：挑选无霉变的葵花籽柏，脱脂，脱脂试剂为石油醚，脱脂温度为 40°C，时间为12h;低温烘干，粉碎，过100目筛； (2) 超声处理：称取步骤（1)制备的葵花籽柏于萃取容器中，按照料液比为1:15的比例 添加混合萃取溶剂，进行超声处理，其中超声功率为220W、温度41°C、时间34min; 所述的混合萃取溶剂：按照[Bmim]BF4与水的体积比为1:4的比例混合，制备获得； (3) 离心：对步骤（2)制备的混合溶液进行离心处理，其中离心时间为10分钟，转速为 8000r/min，取上清液，上清液在30°C的条件下进行浓缩，浓缩液在_50°C的条件进行冷冻 干燥； (4) 纯化：将步骤（3)冷冻干燥后的绿原酸，制备为浓度为1. 06mg/ml-l. 59mg/ml的绿 原酸溶液，上NKA-2大孔树脂柱，上样量的流速为2BV/h，上样量为3BV;用3BV的60%的乙 醇以2BV/h的流速进行洗脱，洗脱液浓缩，得到葵花籽柏浓缩液； (5)溶致结晶纯化技术：步骤（4)制备的葵花籽柏浓缩液调节pH，使葵花籽柏浓缩液 的pH值为2. 0 ;以乙酸乙酯为萃取溶剂，萃取时间25min，萃取四次，并在40°C下真空干燥 2h，得到淡黄色葵花籽柏绿原酸。2. 如权利要求1所述的一种葵花籽柏绿原酸的制备方法制备的葵花籽柏绿原酸。3. 如权利要求2所述的葵花籽柏绿原酸在面包保鲜中的应用。
【专利摘要】本发明公开一种葵花籽粕绿原酸的制备方法及其应用。通过以葵花籽粕为原料，采用超声辅助离子提取法提取葵花籽粕绿原酸，利用NKA-2大孔树脂-溶致结晶联用技术对提取获得的葵花籽粕绿原酸进行纯化，制备获得葵花籽粕绿原酸。本发明制备的葵花籽粕绿原酸具有较强的总抗氧化活性、清除·OH自由基和DPPH·自由基的能力；对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、黑曲霉均有抑制作用；将葵花籽粕绿原酸添加到面包中，可以使面包的贮藏期延长33.3%；可见，本发明具有广泛的应用价值。
【IPC分类】C07C67/48, A23L3/3517, C07C69/732
【公开号】CN105384632
【申请号】CN201510681717
【发明人】敬思群
【申请人】新疆大学, 敬思群
【公开日】2016年3月9日
【申请日】2015年10月19日