物设施标准作业程序并得到香港大学动物伦理委员会的批准。麻醉后，共56只小鼠 (14只/组）经鼻腔接种60%致死量（LD60)的流感HlNl病毒株A/HK/415742Md/09。药物 在病毒接种6小时后由鼻腔途径给药，每日2次，共3天。第一组的小鼠接受20微升2. 5毫 克/毫升的PAC-3-A-1 (即2. 5毫克/千克体重）。第二组的小鼠经鼻腔接受20微升2. 5 毫克/毫升的PAC-3。第三组的小鼠经鼻腔接受20微升2. 5毫克/毫升的扎那米韦作为阳 性对照。最后一组小鼠经鼻腔注射以20微升PBS作为阴性对照。动物的生命体征总共监 测21天或直至死亡。在病毒接种后的第4天，随机从每组小鼠中选取四只处死后收集肺部 组织。一半的肺组织碾磨后取上清采用空斑法和RT-qPCR法测定病毒滴度，另一半肺组织 立即被固定在10%福尔马林中进行的组织病理学分析。
[0031] 1. 6抗病毒机理的研究
[0032] 为了确定病毒生命周期中的哪个阶段被PAC-3-A-1干扰，MDCK细胞首先接种2个 MOI的流感HlNl病毒。此后，PAC-3-A-1 (20微摩）分别在病毒进入细胞时（-Ih)或在感染 后Ih后添加入培养基。对于前者（即-Ih)，病毒、细胞与PAC-3-A-1共孵育1小时后替换 以新鲜的不含化合物的培养基；对于后者，PAC-3-A-1 -直存在于培养基中。病毒接种细胞 6小时后，利用RT-qPCR技术检测细胞内及上清液中的病毒滴度。此外，我们还检测了病毒 在RNA复制和转录水平上的变化，即细胞内mRNA及病毒基因组RNA(vRNA)的数量。简单地 说，MDCK在接种2个MOI的流感病毒后，添加20微摩的PAC-3-A-1。分别在感染后3小时 和6小时，采用组织RNA提取试剂盒（购自QIAGEN)提取细胞内总RNA用于RT-qPCR分析。 在实验中，扎那米韦（100微摩）被用于病毒释放抑制剂的阳性对照。
[0033] 2、结果
[0034] 我们接着测定了化合物PAC-3的选择性指数（selectivity index)(表1)并筛选 了化合物PAC-3的类似物以期得到水溶性好，抗病毒效果更佳的小分子化合物。选择性指 数由MTT试验所得出的半数细胞毒性浓度（即CC50)除以半抑制病毒浓度（EC50)计算获 得。同时，在表1中，我们也罗列了化合物PAC-3在ELISA试验中的半数抑制蛋白结合浓 度（即 IC5O)。
[0035] 表1PAC-3的选择性指数
[0037] 由于PAC-3显示出很高的选择性指数。通过PAC-3的母核结构，我们预测并筛选 了 PAC-3的类似物。如表2所示，有两种PAC-3的类似物（即PAC-3-A-1和PAC-3-A-2)被 鉴定拥有抗病毒效果和较高的选择性指数。
[0038] 表 2PAC-3-A-1 和 PAC-3-A-2 的选择性指数
[0040] 2. 1PAC-3和PAC-3-A-1能够提供广谱的抗甲型流感病毒作用
[0041] 首先，发明人比较了 PAC-3和PAC-3-A-1在多周期病毒生长试验中的表现。如 图IA所示，两种化合物均显示了明显的抗病毒作用。针对HlNl亚型流感病毒，使用20微 摩的化合物能够使受感染细胞上清液中的病毒滴度减少1000倍以上。我们进一步评估了 PAC-3-A-1对H1N1、H3N2、H5N1、H7N7、H7N9及H9N2亚型的毒株在细胞水平的抗病毒效果。 如图IB所示，PAC-3-A-1能够以剂量依赖的方式抑制所有测试的流感毒株的复制。然而，不 同亚型的病毒对PAC-3-A-1表现出不同的敏感性。显然，本发明所述化合物PAC-3-A-1可 以至少在体外提供广谱的抗病毒作用。表3显示了本发明所述化合物PAC-3-A-1针对不同 亚型流感病毒的半数抑制浓度。
[0042] 表3PAC-3-A-1的半数效应浓度（ECJ
[0044] 2. 2PAC-3和PAC-3-A-1能够在体内抑制病毒生长
[0045] 为了评估PAC-3-A-1在体内的抗病毒效果，试验小鼠先经过1个LD60的HlNl病 毒感染，6小时之后再通过滴鼻方式接受PAC-3-A-1抑或是PAC-3的药物治疗。如图2A所 示，接受到2. 5毫克/千克体重的PAC-3-A-1或阳性对照（即扎那米韦）滴鼻治疗的小鼠全 部存活，接受PAC-3治疗的小鼠存活80%，而只接受PBS治疗的小鼠有只存活20%。图2B 显示了小鼠在接受病毒接种及药物治疗后体重的变化趋势，接受PAC-3-A-1以及阳性对照 药物治疗的小鼠体重几乎没有变化。在感染过后的第4天，每个组中随机挑选4只小鼠取 肺并通过空斑试验和RT-qPCR测定肺组织中的病毒含量。如图2C结果表明，PAC-3-A-1的 治疗能够显著减少肺组织中的病毒量。此外，如图2D所示的组织病理学检查进一步表明， 经过PAC-3-A-1治疗的小鼠，肺组织间质炎性细胞浸润及肺泡损伤亦得到改善。我们的结 果表明PAC-3-A-1能有效抑制流感病毒在体内的复制。
[0046] 2. 3PAC-3~A-1的抗病毒机制验证
[0047] 为了验证PAC-3-A-1的抗病毒机制，我们首先确定病毒生命周期的哪个阶段被 PAC-3-A-1干扰。结果表明，当PAC-3-A-1在病毒进入细胞的过程中（即-1小时）添加， 之后移除，并没有观察到抗病毒效果（图3A)。相反，在病毒完成进入细胞的过程后再将 PAC-3-A-1添加到培养基时，发现细胞内和上清中的病毒含量都减少了。实验结果提示 PAC-3-A-1不能阻止病毒感染细胞抑或是病毒从细胞释放，而是阻碍病毒复制的过程。进一 步的研究表明PAC-3-A-1抑制了病毒基因组的复制（图3B)。紧接着，我们构建了流感病毒 的微型复制子系统，证明了在PAC-3-A-1的存在下，正常细胞的生存状态没有受到太多影 响，而RNA聚合酶的活力显著下降（图3C)。我们推测，这是由RNA聚合酶无法正常组装所 造成的。
[0048] 最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保 护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当 理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质 和范围。
【主权项】
1. 一种能够抑制流感病毒聚合酶亚基PA与PB1相互作用的化合物，其特征在于，所述 化合物为式（I)、式（II)或式（III)所示的化合物，所述式（I)所示的化合物的结构 式如下：所述式（II)所示的化合物的结构式如下：所述式（III)所示的化合物的结构式如下： 2. 如权利要求1所述的化合物在制备抗流感病毒的药物中的用途。3. 根据权利要求2所述的用途，其特征在于，所述流感病毒为甲型流感病毒。
【专利摘要】本发明提供了一种化合物，所述化合物为式(Ⅰ)、式(Ⅱ)或式(Ⅲ)所示的化合物，所述化合物均能够抑制流感病毒聚合酶亚基PA与PB1相互作用，具有抗流感病毒的功能。
【IPC分类】A61P31/16, C07D487/04
【公开号】CN105384742
【申请号】CN201510873826
【发明人】郑伯建, 袁硕峰, 高一村, 周婕, 吴子柏
【申请人】香港神农有限公司
【公开日】2016年3月9日
【申请日】2015年12月2日