一种具有抑制霉菌活性的植物乳杆菌及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种植物乳杆菌及其应用，具体涉及一种具有抑制霉菌功能的植物乳 杆菌及其应用。
【背景技术】
[0002] 中国人喜欢吃酱菜，然而现有的酱菜为延长酱菜保质期通常采用盐渍和添加防腐 剂，使得酱菜盐度大，钠含量高，且含有大量的防腐剂，容易对人体造成伤害，人们也渐渐对 酱菜失去了兴趣。因此，亟需一种既能保持酱菜固有的品质，还能达到延长低盐、低防腐剂 添加的酱菜产品保藏期的生物防腐剂。
【发明内容】
[0003] 本发明所要解决的技术问题是，提供一种成本低廉、容易培养、实用性强的对霉菌 具有良好抑制效果的植物乳杆菌菌株、低盐及低防腐剂添加的酱菜生物防腐剂及其应用。
[0004] 本发明解决其技术问题采用的技术方案是，一种具有抑制霉菌功能的植物乳杆 菌，命名为植物乳杆菌 JCMl 149 (Lactobacillus plantarum JCMl 149)，所述菌株 JCMl 149保 藏于中国典型培养物保藏中心，其简称为CCTCC，保藏编号为CCTCC M 2015615,保藏日期为 2015年10月19日，保藏地址：湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学保藏中心，邮编 430072〇
[0005] 本发明进一步解决其技术问题采用的技术方案是，一种生物防腐剂，活性成分为 所述植物乳杆菌。
[0006] 本发明进一步解决其技术问题采用的技术方案是，一种生物防腐剂的制备方法， 将活化后的植物乳杆菌以1~3%接种量接种于新鲜MRS液体培养基，在35~37°C恒温培 养箱静置培养24~26h，然后将菌悬液在冷冻离心机中以2000~4000r/min的转速离心 10~15min，取其上清液，用0. 22 μ m的微孔滤膜过滤除去菌体，置于-60~80°C冰箱中冷 冻12~15h，经过浓缩干燥，然后用无菌蒸馏水溶解制备成十倍浓缩液，即成。
[0007] 进一步，所述MRS液体培养基是由蛋白胨10. 0g，牛肉膏5. 0g，酵母浸粉4. 0g，葡 萄糖20. 0g，磷酸氢二钾2. 0g，柠檬酸三铵2. 0g，乙酸钾5. 0g，七水合硫酸镁0. 2g，硫酸锰 0· 05g，吐温 801. OmL，蒸馏水 1000 mL, 121°C灭菌 15min 制成。
[0008] 本发明进一步解决其技术问题采用的技术方案是，一种具有抑制霉菌功能的植物 乳杆菌在酱菜加工中的应用，每千克酱菜中含6~7X IO8Cfu所述植物乳杆菌。
[0009] 本发明进一步解决其技术问题采用的技术方案是，一种生物防腐剂在酱菜加工中 的应用，每千克酱菜中添加6~IOg所述生物防腐剂。
[0010] 本发明之具有抑制霉菌功能的植物乳杆菌菌株能够对酱菜食品中常见的腐败霉 菌起到良好的抑制作用，既能保持酱菜固有的品质，也能达到延长低盐、低防腐剂添加的酱 菜产品的保藏期，对酱菜行业的发展起到一定的引导和促进作用；同时，本发明制备生物防 腐剂操作简便，成本低廉。
【具体实施方式】
[0011] 下面结合实施例对本发明进一步加以说明。
[0012] 实施例1 :植物乳杆菌菌株的分离、纯化与鉴定
[0013] 1、植物乳杆菌菌株的分离：
[0014] 将6种酱菜样品无菌操作各称取鲜质量10g，切成5mm小丁，加入90mL无菌生理盐 水涡旋震荡3min，然后取悬浮液进行梯度稀释至10 7,接着分别从10 4-10 7稀释度吸取ImL 加入无菌培养皿中，倒入50 °C的含有碳酸钙的MRS固体培养基15-20mL混匀后冷却至室温， 放置于37°C恒温培养箱中培养24-48h至有溶钙圈菌落出现。
[0015] 2、植物乳杆菌菌株的纯化：
[0016] 挑取有溶钙圈的菌落继续在MRS固体培养基上进行分离纯化。将产生溶钙圈的菌 落进行革兰氏染色和过氧化氢酶试验，染色阳性且过氧化氢酶阴性菌株初步定为乳酸菌。 甘油冷冻保藏。
[0017] 3、菌株形态特征及生理生化鉴定：
[0018] 3. 1菌株形态
[0019] 该菌菌落为圆形，颜色呈乳白色，菌落表现光滑，边缘整齐，质地均匀。
[0020] 3. 2生理生化鉴定，结果见表1
[0021] 表1菌株LY-4的生理生化鉴定结果
[0023] 注：" "表示阳性；"一 "表示阴性。
[0024] 由表1可知，菌株经革兰氏染色呈阳性，菌体为杆状。过氧化氢酶试验阴性，明胶 水解阴性，不产H 2S,且能发酵大部分糖类，但对阿拉伯糖、鼠李糖、山梨糖等呈发酵阴性。
[0025] 4、活性菌株的分子生物学鉴定：
[0026] 4. I DNA 的提取
[0027] 采用CTAB法提取乳酸菌的基因组DNA。具体步骤为：
[0028] (1)细菌收集：取2mL，37°C摇床培养16-18h后的MRS菌液于2mL无菌离心管中， 12000rpm离心5min，尽可能的除去培养基，以免残留的培养基影响后续实验结果。
[0029] (2)悬浮菌体：用移液枪加560 μ L的TE buffer溶液到离心管中，轻轻吹打，悬浮 体，使菌体与溶液充分混匀。
[0030] (3)细胞壁的破裂：向菌悬液中加入2 μ L-4 μ L的溶菌酶溶液（20mg/mL)，用移液 枪轻轻吹打2~3下以使溶菌酶与菌体充分接触，在37°C水浴下反应40min使菌体细胞壁 完全破裂。后加入6yL的蛋白酶K溶液（lOmg/mL)溶解蛋白质，再加入30yL的浓度为 10%的SDS溶液沉淀蛋白质（若SDS溶液出现沉淀，应先在37°C水浴下使其溶解，否则会影 响SDS溶液的浓度）。将以上溶液用移液枪吹打混匀，37°C水浴条件下反应45min-60min (至 溶液透明即可）。
[0031] (4)去除多糖成分：向上述透明溶液中加入100 μ L的NaCI溶液（5mol/L)，轻轻震 荡混匀，放入65°C恒温水箱内反应2min。加入80 μ L的CTAB/NaCI溶液（使用前65°C预 热），枪头吹打几下65°C水浴反应lOmin。
[0032] (5)抽提：向上一操作的离心管中，加入等体积（约800 μ L)的氯仿/异戊醇溶 液（24:1)来变性和沉淀蛋白质，12000rpm离心5min后将上层透明液体转移至另一洁净的 2mL离心管中。
[0033] (6)再次抽提：向上层透明液体中加入等体积（约800 μ L)的苯酚/氯仿/异戊 醇混合液（25:24:1)以再次沉淀蛋白质，12000rpm离心5min将上层透明液体转移至另一洁 净的2mL离心管中。
[0034] (7)三次抽提：向上清液2中加入等体积（约600 μ L)的氯仿/异戊醇混合液 (24:1)，以将蛋白质等杂质除尽，12000rpm离心5min，将上清液（含DNA)转移至另一洁净 的I. 5mL离心管中。
[0035] (8)沉淀：向上清液3中加入0· 7倍体积（约400 μ L)的异丙醇，轻轻颠倒离心管 数次。室温放置20min以沉淀DNA。12000rpm离心15min，倒掉上清液，提取效果较好的可 看见在管底有白色沉淀出现。
[0036] (9)洗涤：用70%乙醇（只溶解杂质，不溶解DNA)洗涤沉淀，加入量为500 yL，用 枪吹打使沉淀分散，充分洗涤后12000rpm离心15min，去除上层乙醇，倒扣离心管以除去管 壁附着的水分。
[0037] (10)溶解：加入100 μ L双蒸水溶解DNA沉淀。
[0038] (11)用琼脂糖凝胶电泳检测所提取DNA的效果，琼脂糖百分含量0. 7%，DNA溶液 点样量为5 μ L，用A-EcoTH I digest DNA Marker作为分子大小的标记，点样量为3 μ L， 电泳完成后凝胶成像可观测到所提DNA是否完整。完整DNA溶液放于-20°C冰箱何中保存 备用。
[0039] 4. 2植物乳杆菌16SrDNA的PCR扩增与测序
[0040] 以乳酸菌菌株基因组DNA为模板，利用扩增细菌16SrDNA的通用引物 27f(5' -AGAGTTTGATCCTGGCTCAG)和 1495r(5' -CTACGGCTACCTTGTTACGA)，对乳酸菌的 16SrDNA进行PCR扩增。PCR扩增程序为：94°C预变性4min ;然后94°C变性45s、56°C退火 lmin、72°C延伸lmin，30个循环；72°C延伸lOmin。PCR产物大小经过琼脂糖凝胶电泳检测 验证后，将目标条带送至北京英俊生物工程有限公司进行测序。
[0041] 4. 3同源性分析与系统发育树的构建
[0042] 采用核酸BLAST技术，将测序获得的序列信息与NCBI网站里的GeneBank数据 库进行对比，找到与所测序列同源性最高的已知分类地位的菌种。然后从GenBank/EMBL/ DDBJ数据