此证实的菌株经pCP20载体再次转化后在LB培养基中培养，其中氯霉 素标记物被去除并且metA基因被metA (EH)取代的菌株被命名为"W3-BTA"。
[0097] 〈1_4>构建具有2个拷贝的ppc、aspC和asd基因的菌株（欧洲专利申请公开号 EP 2290051)
[0098] 为增加参考实施例〈1_3>构建的W3-BTA菌株的0-乙酰基高丝氨酸生产能力，通 过引用此前提交的专利EP 2290051来增强生物合成途径。以与上述EP专利相同的方式， 构建如下每种基因具有2个扩增拷贝的菌株：即，编码磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的ppc基因， 利用SEQ ID NOS :46、47、48和49的引物；编码天冬氨酸氨基转移酶的aspC基因，利用SEQ ID NOS :50和51的引物；和编码天冬氨酸半醛脱氢酶的asd基因，利用SEQ ID NOS :52、53、 54和55的引物。具体地，在生产0-乙酰基高丝氨酸时生物合成途径增强的上述菌株被命 名为 "W3-BTA2PCD"（也被称为 "WCJM"）。
[0099] 〈1_5>烧瓶培养实验
[0100] 通过爱伦美氏烧瓶培养，测试参考实施例〈1_3>和〈1-4>构建的菌株的0-乙酰基 高丝氨酸产量。
[0101] 具体地，将W3110、W3-BTA、和WCJM菌株接种于LB培养基，并在33°C下培养过夜。 然后，将其单个集落接种于3mL LB培养基，在33°C下培养5小时，在包含25mL 0-乙酰基 高丝氨酸生产培养基的250mL爱伦美氏烧瓶中稀释200倍，在33°C下在200rpm转速下培 养30小时，并通过HPLC分析测定0-乙酰基高丝氨酸产量。所用培养基组成显示在下表1 中，并且测定的0-乙酰基高丝氨酸产量显示在下表2中。
[0102] [表1]0_乙酰基高丝氨酸生产烧瓶培养基的组成
[0107] 结果表明，野生型W3110完全不生产0-乙酰基高丝氨酸，而W3-BTA菌株生产 0. 9g/L 0-乙酰基高丝氨酸，并且生物合成途径强化的WCJM菌株生产I. 2g/L 0-乙酰基高 丝氨酸。
[0108] 实施例1 :去除柠檬酸合酶活件
[0109] 〈1_1>在〇-乙酰基高丝氨酸生产微生物中构建柠檬酸合酶基因敲除微生物
[0110] 柠檬酸合酶（GltA)是TCA循环的第一步中的酶，并且始于草酰乙酸盐和乙酰 辅酶A之间的反应。众所周知TCA循环减少导致生长抑制（Meded Rijksuniv Gent Fak Landbouwkd Toegep Biol Wet. 2001 ;66 (3a) :333-6)。然而，为增加乙酰辅酶 A (用作 〇-乙 酰基高丝氨酸的底物）的量，将要生产去除了柠檬酸合酶活性的W3-BTA和WCJM菌株。
[0111] 具体地，利用SEQ ID NOS :56和57的引物，基于PKD4载体作为模板，通过PCRJn 下敲除W3-BTA和WCJM菌株中的柠檬酸合酶基因：94°C变性30秒，55°C退火30秒，和72°C 延伸2分钟，30个循环。将所得PCR产物在1. 0%琼脂糖凝胶上进行电泳，证实基因尺寸为 I. 6kb，并纯化其DNA。将回收的DNA片段电穿孔到已被pKD46载体转化的W3-BTA和WCJM 菌株中。关于电穿孔，将PKD46载体转化的W3-BTA和WCJM菌株在30°C下在包含100 μ g/ L氨苄西林和5mM阿拉伯糖的LB培养基中培养，直到0D_= 0. 6,并用蒸馏水洗涤两次和 10%丙三醇洗涤一次，待用。电穿孔在2500V下进行。将由此回收的菌株在包含50 μ g/L 卡那霉素的LB平板上划线，在37°C下培养，并选择显示抗性的菌株。
[0112] 将选择的菌株在相同条件下利用SEQ ID NOS :58和59的引物进行PCR，在1. 0% 琼脂糖凝胶上进行电泳，并观察到基因尺寸为2. 5kb，从而证实缺失盒被插入染色体的柠檬 酸合酶基因部分。将由此证实的菌株用PCP20载体再次转化，在LB培养基中培养，并通过 PCR构建敲除了柠檬酸合酶基因，在1. 0%琼脂糖凝胶上尺寸减少至I. Ikb的菌株，并且证 实卡那霉素标记物被去除。由此构建的菌株分别被命名为"W3-BTA-AD"和"WCJM-AD"。
[0113] 〈1_2>评价0-乙酰基高丝氨酸生产微生物中的柠檬酸合酶基因敲除微生物
[0114] W3-BTA-AD和WCJM-AD菌株可在LB培养基中生长，但由于敲除了柠檬酸合酶基因， 其不能在包含〇-乙酰基高丝氨酸的培养基中生长。为测试〇-乙酰基高丝氨酸产量，在培 养基现有组成中添加3g/L谷氨酸盐的条件下（表3--培养基中添加谷氨酸盐的组成）进 行爱伦美氏烧瓶培养。
[0115] 具体地，将W3-BTA-AD和WCJM-AD菌株接种于LB培养基，并在33°C下培养过夜。 然后，将其单个集落接种于3mL LB培养基，在33°C下培养5小时，在包含25mL 0-乙酰基高 丝氨酸生产培养基（添加了谷氨酸盐）的250mL爱伦美氏烧瓶中稀释200倍，在33°C下在 200rpm转速下培养30小时，并通过HPLC分析测定0-乙酰基高丝氨酸产量。测定的0-乙 酰基高丝氨酸产量显示在下表4中。
[0116] [表3]在基础培养基中添加谷氨酸盐的培养基的组成
[0118][表4]通过烧瓶培养生产0-乙酰基高丝氨酸
[0121] 通过烧瓶培养进行0-乙酰基高丝氨酸生产的结果表明，W3-BTA菌株生产0. 9g/L 0-乙酰基高丝氨酸，而W3-BTA-AD生产I. 4g/L 0-乙酰基高丝氨酸，增加 55. 6%，尽管显示 其葡萄糖消耗减少。WCJM菌株生产I. 3g/L 0-乙酰基高丝氨酸，而WCJM-AD菌株生产2. Ig/ L 0-乙酰基高丝氨酸，因此证实由于敲除了柠檬酸合酶基因，0-乙酰基高丝氨酸生产能力 提尚61. 5%。
[0122] 实施例2 :柠檬酸合酶蛋白活件减弱
[0123] 〈2_1>柠檬酸合酶基因修饰种类
[0124] 实施例〈1_1>构建的WCJM-AD菌株显示低培养速率，并且根据在大量参考文献 (The Journal of Biological Chemistry, 2003, 278, 35435-35443)中已知的各种朽1 樣酸合 酶修饰，选择显示活性减弱和乙酰辅酶A结合能力降低的三种不同类型的变体。关于这三 种不同变体类型的信息显示在显示修饰基因的表5中，其中第145位氨基酸，酪氨酸（Y)，被 丙氨酸（A)取代，第167位氨基酸，赖氨酸（K)，被丙氨酸（A)取代，和第204位氨基酸，苏氨 酸（T)，被丙氨酸㈧取代。
[0125] [表 5]
[0126] 柠檬酸合酶（gltA)变体评价
[0128] 〈2_2>在0-乙酰基高丝氨酸生产微生物中构建柠檬酸合酶蛋白活性减弱的微生 物
[0129] 发明人意图通过将如实施例〈2_1>所示柠檬酸合酶蛋白活性减弱的变体引入 〇-乙酰基高丝氨酸生产微生物来增加生产能力。
[0130] 为将这三种不同类型的柠檬酸合酶基因变体引入WCJM-AD菌株，如图1所示设计 修饰替换盒。通过用核苷酸取代引物来合成各变体，并通过3种PCR产物构建各盒。关于 柠檬酸合酶基因部分，利用W3110菌株作为模板，并且第145位氨基酸修饰，分别利用SEQ ID NOS :60和63以及SEQ ID NOS :62和61的引物，通过进行PCR反应，产生并获得尺寸为 514bp 和 1，112bp 的 PCR 产物。
[0131] 同样，利用SEQ ID NOS :60和65的引物和SEQ ID NOS :64和61的引物，第167位 氨基酸修饰产生尺寸为580bp和l，046bp的PCR产物，而利用SEQ ID NOS :60和67以及SEQ ID NOS :66和61的引物，第204位氨基酸修饰产生尺寸为688bp和936bp的PCR产物。关 于共同的卡那霉素部分，利用SEQ ID NOS :68和69的引物，基于pKD4载体作为模板，进行 PCR反应。具体地，为插入柠檬酸合酶基因位置，构建包括SEQ ID NO :69中柠檬酸合酶基 因的下游多核苷酸序列的盒，并通过电泳获得1，571bp尺寸的PCR产物。分别利用SEQ ID NOS :60和69的引物，基于卡那霉素 DNA片段（根据修饰收集的两个DNA片段中每一个的 共同部分），如下进行缝合PCR反应（sewing PCR reaction) :94°C变性30秒，55°C退火30 秒，和72°C延伸4分钟，30个循环。在I. 0%琼脂糖凝胶上验证各最终PCR产物，并且三个 不同种类的柠檬酸合酶基因修饰盒得到3, 115bp尺寸的DNA片段。将收集的DNA片段电穿 孔到已被PKD46载体转化的WCJM-AD菌株中。关于电穿孔，将pKD46转化的W3110菌株在 30°C下在包含100 μ g/L氨苄西林和5mM阿拉伯糖的LB培养基中培养，直到0D6。。= 0. 6,并 且在用无菌蒸馏水洗涤两次和10%丙三醇洗涤一次后使用。电穿孔在2500V下进行。将回 收的菌株在包含25 μ g/L卡那霉素的LB平板上划线，在37°C下培养过夜，并选择显示抗性 的菌株。利用相同的SEQ ID NOS :58和59的引物，基于该菌株作为模板，在相同条件下，使 选择的菌株进行PCR反应，并通过观察到I. 0 %琼脂糖凝胶上3. 7kb的基因尺寸证实metB 基因的敲除，从而证实修饰盒（其中柠檬酸合酶基因的氨基酸被取代）被插入。将由此证 实的菌株经PCP20载体再次转化后在LB培养基中培养，并且构建关于柠檬酸合酶活性的三 种变体菌株（通过相同条件下进行的PCR，在1. 0%琼脂糖凝胶上，基因尺寸减少至2. 5kb)， 并且证实卡那霉素标记物的去除。由此构建的菌株被命名为"WCJM-A145"、"WCJM-A167"、 和"WCJM-A204"，并且引入了修饰的柠檬酸合酶基因的序列信息分别显示在SEQ ID NOS :1 至3 (氨基酸序列）和SEQ ID NOS :5至7 (核苷酸序列）中。
[0132] 〈2_3>在0-乙酰基高丝氨酸生产微生物中评价柠檬酸合酶活性减弱的微生物
[0133] 进行爱伦美氏烧瓶培养以测定柠檬酸合酶基因活性减弱的三种不同菌株 WCJM-A145、WCJM-A167和WCJM-A204的0-乙酰基高丝氨酸产量。将四种菌株--即， 賈^]\^145、1(^]\^167、和1(^]\^204菌株，包括1(：舅菌株--接种于LB培养基，并在33°C 下培养过夜。然后，将其单个集落接种于3mL LB培养基，在33 °C下培养5小时，在包含25mL 0-乙酰基高丝氨酸生产培养基的250mL爱伦美氏烧瓶中稀释200倍，在33°C下在200rpm转 速下培养30小时，并通过HPLC分析测定0-乙酰基高丝氨酸产量。结果显示在下表6中。
[0134] [表6]通过烧瓶培养生产0-乙酰基高丝氨酸
[0136] 通过烧瓶培养进行0-乙酰基高丝氨酸生产的结果表明，WCJM菌株生产I. 3g/L ο-乙酰基高丝氨酸，并且两菌株WCJM-A145和WCJM-A167分别生产2. Og/L和I. 9g/L 0-乙 酰基高丝氨酸，同时随着其吸光度（OD)减少，其葡萄糖消耗量减少。考虑到谷氨酸盐从 I. 3g/L具体减少至Og/L，证实该结果是由柠檬酸合酶活性减弱导致的TCA循环流减少造 成的。然而，WCJM-A204菌株显示谷氨酸盐增加，同时显示0-乙酰基高丝氨酸产量减少至 0. 2g/L，因此证实该修饰是活性强化修饰。
[0137] 实施例3 :梓檬酸合酶蛋白表达减弱
[0138] 〈3_1>构建柠檬酸合酶基因反义RNA(asRNA)的表达载体
[0139] 发明人试图利用反义RNA(asRNA)技术来减弱柠檬酸合