0. 06mmol) 在二氯甲烷（3mL)与甲醇（ImL)的混合溶剂中，在氮气气氛下55°C搅拌回流过夜，后将 反应溶液降温至室温，向其中加入KPF 6(1. 4_〇1)继续搅拌4小时，反应结束后旋蒸除去 有机溶剂，并将得到的固体过柱子提纯，得到红色粉末状固体Ir-P(Ph) 3W。产率36%。 1H NMR (400MHz, DMS0) 5 8. 43 (d, J = 8. 1Hz, 1H), 8. 11 (dt, J = 10. 7, 5. 4Hz, 3H), 8. 03-7. 95 (m, 2H), 7. 93 - 7. 70 (m, 22H), 7. 36 - 7. 28 (m, 2H), 7. 23 - 6. 97 (m, 14H), 6. 96 -6. 88 (m, 3H), 6. 86 - 6. 70 (m, 9H), 6. 52 (dd, J = 6. 9, 4. 4Hz, 2H), 4. 37 (s, 2H), 3. 56 (s, 2H), I ? 99 (s, 3H), I. 50 (dd, J = 60.1 , 31. 4Hz, 8H)。
[0040] 实施例3 :铱配合物Ir-P (Ph) 3 (7)的吸收和发射光谱测试
[0041] 本发明采用的光谱测试浓度为10 μ M，测试溶剂为混有1 % DMSO的PBS溶液，测发 射光谱时，激发波长为405nm。
[0042] Ir-P(Ph)J^吸收和发射光谱如图1和图2所示。配合物在紫外区250-380nm以 及可见蓝光区400-500nm均表现出了较强的吸收，特别是该配合物能够被可见光激发，在 做细胞成像实验时大大减少了激发光源对细胞的损伤。其发射较宽，发射峰位于602nm，红 光发射增加了生物组织的穿透深度，使之更适用于生物成像。
[0043] 实施例4 :铱配合物Ir-P (Ph) 3 (7)的MTT细胞毒性实验
[0044] 将消化后的细胞接种在96孔板中，每孔的接种密度为IO4个/孔，在37°C，5% CO2 的条件下继续培养24小时。吸除不新鲜的培养液后用不同浓度Ir-P(Ph)3(7) (1、5、10、25、 50 μ M)的细胞培养液继续培养细胞24小时。每孔加入10 μ L MTT (5mg/mL)继续培养4小 时候终止培养。吸除培养液，每孔加入150 μ L二甲基亚砜，摇床震荡10分钟后使用酶标仪 测试0D570。
[0045] MTT细胞毒性实验结果如图3所示，在配合物的浓度增加至50 μ M时，培养24小时 后，细胞存活率大于80%，证明该配合物具有较低的细胞毒性，可用于细胞成像。
[0046] 实施例5 :铱配合物Ir-P (Ph) 3(7)与商业线粒体染料Mito-Track Green对活细胞 线粒体的共染实验
[0047] 本发明采用的细胞均为人宫颈癌HeLa细胞。将消化后的细胞接种在培养皿中， 在37°C，5% CO2的条件下继续培养24小时使之贴壁。用PBS溶液洗去不新鲜的细胞培 养液后用Ir-P(Ph) 3W (5 μΜ)的细胞培养液孵育细胞12小时。再用含有Mito-Tracker Green (200ηΜ)的细胞培养液继续培养30分钟，用PBS溶液清洗三次后成像。
[0048] 配合物Ir-P(Ph)3(7)与商业线粒体染料Mito-Tracker Green的细胞共染成 像图如图4所示。Mito-Tracker Green由488nm蓝光激发，收集500_540nm绿光发射， Ir-P (Ph) 3 (7)由405nm蓝紫光激发，收集580-640nm红光发射。将线粒体染料Mito-Tracker Green的发射区域与配合物Ir-P(Ph) 3W的发射区域向叠加，发现二者重合度高，由计算可 得，共染系数为〇. 85,证明本发明的配合物Ir-P (Ph) 3 (7)能够靶向活细胞线粒体，可用于活 细胞线粒体标记。
[0049] 实施例6 :铱配合物Ir-P(Ph)3(7)在活细胞中检测线粒体内氧气浓度变化的共聚 焦成像实验
[0050] 将消化后的细胞接种在培养皿中，在37°C，5% CO2的条件下继续培养24小时使之 贴壁。将含Ir-P (Ph)3 (7) (5 μ M)的细胞培养液培养细胞12小时使之进细胞。成像时，将 培养皿置于活细胞工作站中，分别向活细胞工作站通入2 %，5 %，10 %，15 %的氧气百分比 的氧气和氮气的混合气，每种氧气浓度的混合气体通气30分钟，以控制细胞所处环境的氧 气浓度。激发光源波长为405nm，成像收集波长为580-640nm。
[0051] 配合物Ir-P(Ph)3(7)在活细胞中检测线粒体内氧气浓度变化的共聚焦成像实验 结果如图5所示，随着氧气浓度的增加，细胞线粒体中配合物的红光发射强度逐渐减弱，证 明通过共聚焦成像技术，该配合物能够很好的传感细胞内线粒体中氧气浓度的变化。
[0052] 实施例7 : Ir-P (Ph) 3 (7)在活细胞中检测线粒体内氧气浓度变化的寿命成像实验
[0053] 将消化后的细胞接种在培养皿中，在37°C，5% CO2的条件下继续培养24小时使之 贴壁。将含Ir-P (Ph)3 (7) (5 μ M)的细胞培养液培养细胞12小时使之进细胞。成像时，将 培养皿置于活细胞工作站中，分别向活细胞工作站通入2 %，5 %，10 %，15 %的氧气百分比 的氧气和氮气的混合气，每种氧气浓度的混合气体通气30分钟，以控制细胞所处环境的氧 气浓度。激发光源为405nm的脉冲激光，频率为0. 5Hz。
[0054] 配合物Ir-P(Ph)3在活细胞中检测线粒体内氧气浓度变化的寿命成像实验，结果 如图6所示，随着氧气浓度的增加，细胞线粒体中配合物的红光发射寿命逐渐变小，同时亦 能区分长达几百纳秒寿命的目标信号和几纳秒的背景荧光干扰，证明通过寿命成像技术， 该配合物不仅能够提高信噪比，还能够很好的传感细胞内线粒体中氧气浓度的变化。
【主权项】
1. 一类具有线粒体祀向功能的憐光银配合物，其特征在于该银配合物具有如下结构 式：其中，C~N配体为下列中的任一个： 2. 权利要求1所述的具有线粒体祀向功能的憐光银配合物的制备方法，其特征在于该 方法的合成路线如下：具体是化合物1与甲醇钢溶液在室溫下揽拌反应22小时后，加入氯化锭继续反应6小 时，过滤除去未反应的氯化锭，滤液旋干除去甲醇溶剂，得到浅黄色固体粉末，然后用乙酸 洗涂Ξ次，除去未反应的化合物1，再使用乙醇-乙酸的混合溶剂重结晶，得到白色产物化 合物2 ;在乙醇钢催化下化合物2与乙酷乙酸乙醋加热回流24小时后，旋干除去溶剂并将 固体溶于30血去离子水中，调节抑值至4-5,有大量白色固体析出，过滤得该白色固体，并 用乙酸和水洗涂立次，得到白色固体化合物3 ;化合物3J2CO3与1，6-二漠己烧溶于丙酬后 在氮气气氛中60°C揽拌回流过夜，反应结束后用水和二氯甲烧萃取Ξ次除去多余的K2CO3， 收集有机相，干燥除水后旋蒸除去有机溶剂，将得到的油状混合物过柱子提纯，得到黄色油 状液体化合物4 ;将化合物4和Ξ苯基憐（2mmo1)溶于N，N-二甲基甲酯胺中，在氮气气氛中 l〇〇°C回流72小时，反应结束后减压旋蒸除去N，N-二甲基甲酯胺，将得到的油状液体过柱 子提纯，得到蜡状白色凝脂化合物5 ;最后将化合物5和银二氯桥在二氯甲烧与甲醇（ImL) 的混合溶剂中，在氮气气氛下55°C揽拌回流过夜，后将反应溶液降至室溫，向其中加入KPFe 继续揽拌4小时，反应结束后旋蒸除去有机溶剂，并将得到的固体过柱子提纯，得到红色粉 末状固体Ir-P(Ph)3(l-7)。3. 权利要求1所述的具有线粒体祀向功能的憐光银配合物的应用，其特征在于该材料 应用于活细胞线粒体的标记。4. 权利要求1所述的具有线粒体祀向功能的憐光银配合物的应用，其特征在于该材料 应用于通过共聚焦成像和寿命成像技术检测活细胞线粒体内氧气浓度的变化。5. 如权利要求1所述的具有线粒体祀向功能的憐光银配合物的应用，其特征在于该材 料应用于细胞成像、生物标记和传感领域。
【专利摘要】本发明公开了一类具有线粒体靶向功能的磷光铱配合物及其制备方法及其在生物成像与氧气检测中的应用。该配合物由环金属配体，金属中心和含有线粒体靶向官能团的辅助配体组成，结构通式如下；本发明的配合物的发光强度以及发射寿命会随着氧气浓度的增加而减少；并能够对活细胞的线粒体进行标记；还能够通过共聚焦成像和寿命成像技术检测活细胞线粒体内氧气浓度的变化；本发明所述的磷光铱配合物材料在生物成像与传感方面具有重要的应用前景。
【IPC分类】G01N21/31, C07F15/00, C09K11/06, G01N21/39
【公开号】CN105399775
【申请号】CN201510674269
【发明人】赵强, 黄维, 吕雯, 许文娟, 刘淑娟, 张璋
【申请人】南京邮电大学
【公开日】2016年3月16日
【申请日】2015年10月16日