目的是实施将至少一部分葡萄糖转化成寡糖，所述寡糖具有诱导真菌中的纤维素酶编码基因的表达的性质。特别地，该孵育步骤可用于生产槐糖(经β -1-2键连接的葡萄糖分子的二聚体)和/或龙胆二糖(经β -1-6键连接的葡萄糖分子的二聚体)。该寡糖溶液优选含有总浓度(槐糖+龙胆二糖)通常低于30g/L的槐糖和龙胆二糖的混合物。这两种寡糖(或二糖)是丝状真菌中，特别是里氏木霉中的纤维素酶分泌的有力诱导剂。
[0051]这种孵育步骤包括将该水解产物加热到40°C至70°C，优选50°C至65°C的温度0.1至100小时，优选至少24小时，非常优选24至72小时。
[0052]在孵育步骤结束时，经管线16从孵育器11中取出包含寡糖的水溶液。
[0053]根据该寡糖合成方法的另一实施方案(未显示在图1中)，在固/液分离单元中处理经管线8取出的水解产物，从该固/液分离单元中提取固体部分和含有葡萄糖和纤维素酶的液体水解产物部分。然后根据上述三个实施方案之一以在孵育步骤前降低其水含量的方式处理该水解产物的液体部分。这种固/液分离步骤可以使用下列技术之一:离心、沥干、施压、过滤和沉降。
[0054]参考图1，本发明的方法可包括对获自预处理反应器的流出物进行的使用单元17的任选固/液分离步骤。这一步骤因此可用于:
?经管线18提取出含有获自半纤维素的糖(例如木糖、阿拉伯糖、半乳糖和甘露糖)的液体部分；和
?经管线2a提取出含固体的部分(预处理过的生物质)，将其送往水解反应器3。
[0055]根据图1，将所有或一部分液体部分18经管线20直接与获自孵育器11的流出物混合，或独自或作为与获自水解步骤的水解产物的混合物经管线19送往蒸发器14以蒸发水，或独自或作为与水解产物的混合物(经未显示的管线)送往蒸发器9。
[0056]根据本发明，为了降低水解产物中的水含量，可以实施另一方法作为上述方法的替代或补充，其包括将糖添加到水解产物中。
[0057]参考图2，除上文已描述的步骤外，根据本发明的生产纤维素酶的方法实施使用发酵罐4并使用原位合成的寡糖生产纤维素酶的步骤。在发酵罐4中借助经管线6供应的微生物进行酶的生产。该微生物优选选自属于瘤胃球菌属、梭菌属、纤维单胞菌属、Thermonospora、链霉菌属的纤维分解细菌或来自曲霉属、青霉属或木霉属的纤维分解真菌。其中，里氏木霉是优选物种，因为其能够分泌大浓度的高活性纤维素酶。
[0058]如图2中可以看出，将经管线16从孵育器11中提取出的所有或一部分流出物送往发酵罐4。
[0059]在搅拌和充气发酵罐中在与它们的生长和酶的生成相容的条件下孵育这些菌株。可以使用技术人员已知的适用于该微生物的任何类型的生产方法。特别可以使用如文献FR2 555 603中描述的“分批补料”型方法。
[0060]为此，制备含有该微生物和培养基(其包含常见的无机盐和维生素补充剂和优选为可溶糖(例如乳糖、葡萄糖、木糖或阿拉伯糖)形式的碳和能量源)的预培养物。然后将该预培养物转移到包含含有至少一种糖的培养基并定期补充寡糖-诱导溶液的用于生产酶的发酵罐中。接着，在该发酵罐中通过使微生物与培养基之间保持必要的接触和通过有规律地送入寡糖-诱导溶液(例如连续)来生产酶。
[0061]在初始碳源耗尽后，定期或连续喷入含诱导剂寡糖的水溶液，以送入在35至135毫克总糖(含有诱导剂寡糖)/克细胞/小时范围内，优选在35至45毫克范围内的最佳量。
[0062]如图2中所示，经管线5从发酵罐4中取出所有或一部分含有相关纤维素酶的发酵汁以供应水解反应器3。
[0063]图3是包含使用由该方法内部的料流生成的寡糖生产纤维素酶的单元的生产醇、溶剂或有机酸的方法的一个实施方案的图示。
[0064]参考图3，将未用于原位合成寡糖的那部分(或一部分)水解产物经管线21送往用于发酵该水解产物中存在的糖的单元22。
[0065]在发酵单元22中，使该水解产物与经管线23引入的一种或多种发酵微生物接触。由此通过微生物将可发酵的糖转化成单独或作为混合物的醇、溶剂或有机酸。单元22中的发酵步骤可以在30°C至40°C的温度和3至6.5的pH下进行。在发酵步骤结束时，获得发酵汁，其经管线24从单元22中排出并包含悬浮的材料和含一种或多种所需产物(醇和/或溶剂)的液相。
[0066]获自发酵单元22的发酵汁经管线24引入分离单元(未显示)，其可用于将该发酵汁分离成不同产物:醇和/或溶剂、含有未发酵的糖的液体釜馏物和主要含有木质素以及尚未水解的纤维素和半纤维素的固体残余物。
[0067]例如，该发酵的类型可以是:
a) “乙醇”型，其相当于借助酵母(例如酿酒酵母(S.cerevisiae))或细菌(例如运动发酵单胞菌(Z.mobilis))或其它微生物生产乙醇作为主要醇。
[0068]b) “丁醇(butylic)”型，其本身在此包括:
?仅产生正丁醇的发酵；
? “ABE”发酵，其相当于生产包含丙酮、正丁醇(主要产物)和乙醇的混合物。也可能存在痕量异丙醇；
?“IBE”发酵，其相当于生产异丙醇、正丁醇(主要产物)和乙醇；
这些发酵通常使用梭菌属的微生物进行并在严格的厌氧条件下进行；
?“异丁醇型(isobutylic)”发酵，其通常相当于仅生产异丁醇。许多微生物(都基因改造)能利用氨基酸途径进行这种转化(例如大肠杆菌、棒状杆菌、酿酒酵母)；c) “丙醇(propylic)”型，其相当于生产丙醇或异丙醇。
[0069]根据包含使用由该方法内部的料流生成的寡糖生产纤维素酶的单元的生产醇和/或溶剂的方法的一个实施方案，与酶法水解步骤同时进行糖发酵成醇和/或溶剂(“SSF”实施方案，同时糖化和发酵)。参考图4，经管线2和25将获自预处理单元1的流出物分成两个料流。将含有预处理过的生物质的料流2送往如对图2描述的用于原位生产纤维素酶的单元。将料流25转移至SSF发酵单元26，其同时进行:
?借助经管线27供应的来自纤维素酶的原位生产单元4的纤维素酶水解纤维素；和 ?借助经管线23引入的微生物发酵在酶法水解过程中释放的可发酵糖。
[0070]当酶法水解和乙醇发酵在一个相同操作中进行(SSF法)时，温度通常为30°C至45°C，且 pH 为 4 至 6。
[0071]应该指出，在本发明的生产醇和/或溶剂的方法的内容中完全可以合并对生产寡糖和纤维素酶的方法描述的实施方案。
实施例
[0072]缩写“DM”在下文中用于培养基中存在的干物质(固体和可溶物)。根据ASTM方法E1756-01测定干物质的量(或“总固体量”)，其包括在105 °C下直到获得恒重时的重量损失。
[0073]实施例1 (不符合):
在包含15重量％ DM (15克稻草干物质/100克总质量)的培养基中使用由里氏木霉生成的纤维素酶混合物进行通过酸消化预处理的稻草的酶法水解。用于水解的纤维素酶的量固定为10毫克纤维素酶/克干物质(DM)。该混合物在搅拌下在50°C下水解72小时。在水解结束时，回收粗制水解产物，其具有75 g/L的葡萄糖浓度和10 IU/mL的β -葡糖苷酶活性。此外，该液体部分的水含量为该液体部分的重量的92重量％。
[0074]然后将该粗制水解产物在搅拌下在50°C下孵育24小时。在孵育期结束时，将该水解产物煮沸5分钟以使酶变性，然后通过HPLC分析。分析表明该水解产物不含寡糖。
[0075]不符合本发明的实施例1表明，孵育具有大于65重量％的水含量的水解产物无法将至少一部分葡萄糖转化成寡糖，特别是转化成槐糖和/或龙胆二糖。
[0076]实施例2 (根据本发明)
在实施例1中获得的粗制水解产物中补充60重量％葡萄糖糖浆以获得具有500 g/L的葡萄糖浓度和该液体水解产物部分的总重量的57.5重量％水的水含量的液体部分。该混合物在搅拌下在50°C下孵育24小时。在孵育期结束时，将该混合物煮沸5分钟以使酶变性，然后通过HPLC分析。所得水解产物含有22 g/L的槐糖和龙胆二糖的混合物和477 g/L的葡萄糖(即葡萄糖4.4%转化成寡糖)。
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