拮抗作用
[0068] 采用对峙培养法测定甲基营养型芽孢杆菌ZBL-1对不同大丽轮枝菌的拮抗。
[0069] (1)用直径为5mm的打孔器在培养好的大丽轮枝菌（Verticillium dahliae Kleb.)ZBL-1菌落边缘打取菌饼，用灭菌的接种针挑入PDA平板中心。
[0070] (2)在距PDA平板中心20mm处三点划线接种相同体积和浓度的ZBL-1，以仅接种大 丽轮枝菌菌饼的PDA平板为对照组，28°C培养7d，测量抑菌带宽，抑菌带宽度是指病原菌边 缘至拮抗菌株边缘的最短距离，计算抑制率。每处理三个重复。结果如表4、表5所示。
[0071] 抑制率计算公式：
[0072] 抑制率（％ )=(对照直径一处理处理)/对照直径X 100%
[0073] 表4ZBL-1对20株不同大丽轮枝菌的抑制率(培养15d)
[0074]
[0075] 表5ZBL-1对20株不同大丽轮枝菌的抑菌带宽(培养15d，单位:mm)
[0076]
[0077]
[0078] 由表4可知，ZBL-1对20株不同大丽轮枝菌具有不同的抑制能力，对峙培养15d时平 均抑制率为75.5% ;其中ZBL-1对落叶型菌株D143-8的抑菌率最高，为81.6% ;ZBL-1对菌株 N51-8的抑菌能力最低，为71.0%;因此，ZBL-1对大丽轮枝菌有很强的抑制效果。
[0079]由表5可知，ZBL-1对20株不同轮枝菌的抑菌宽度平均为11mm，整体表现出很强的 抑菌能力。
[0080]实施例五：甲基营养型芽抱杆菌（Baci 1 lus methylotrophicus)ZBL-1CGMCC No. 11636挥发性气体对大丽轮枝菌的拮抗作用
[0081 ]取100yL的生防菌培养液涂布于LB平板上，将直径5mm的大丽轮枝菌接种于PDA平 板中心，将以上两个平板对扣后用封口膜封严密，只涂了培养基的平板与接种病原菌的PDA 平板对扣作为对照组，25°C培养，由于大丽轮枝菌生长较慢，10d后检测各处理病原菌生长 的菌落半径，每处理三个重复。
[0082]由测定结果可知，ZBL-1产生挥发性物质对大丽轮枝菌有明显的抑菌作用，参见附 图4,培养10d后抑制率为69.3%。
[0083] 实施例六：甲基营养型芽抱杆菌（Baci 1 lus methy lotrophicus) ZBL-1CGMCC No. 11636对棉花黄萎病的盆栽防效。
[0084] 采用盆栽法测定甲基营养型芽孢杆菌ZBL-1对大丽轮枝菌的拮抗，具体步骤如下：
[0085] (1)待棉苗生长至两叶一心时采用伤根接种法接种ZBL-1菌液(LB培养液稀释）和 大丽轮枝菌孢子悬浮液(PDA培养液），稀释配制。
[0086] (2)试验设6个处理：处理1接种浓度为109cfu/ml的ZBL-1菌液，每营养钵接种 5〇1111。处理2先接种浓度为109(^11/1111的281^-1菌液，每营养钵5〇1111，3(1后再接种浓度为 107cfu/ml的大丽轮枝菌孢子悬浮液，每营养钵50ml;处理3接种浓度为107cfu/ml的大丽轮 枝菌孢子悬浮液，每营养钵接种50ml;处理4空白对照；处理5同时接种浓度为10 9cfu/ml的 ZBL-1菌液和107cfu/ml的大丽轮枝菌孢子悬浮液，每营养钵分别接种50ml;处理6先接种浓 度为10 7cfu/ml的大丽轮枝菌孢子悬浮液，每营养钵5〇1111，3(1后再接种浓度为109(^11/1111的 ZBL-1菌液，每营养钵50ml。其中处理3是对照，其余为试验处理。
[0087]以上每个处理6个营养钵，每个营养钵10株棉苗，结果取平均值。
[0088]大丽轮枝菌接种20d后，观察棉苗的发病情况。
[0089]病情指数计算公式：
[0090] 病情指数=100 X Σ (各级病株数X各级代表值)/(调查总株数X 4)
[0091] 防治效果计算公式：
[0092]防治效果（％ )=(对照病情指数一处理病情指数)/对照病情指数X 100%
[0093]表6ZBL-1对棉花黄萎病的室内盆栽防治效果
[0094]
[0095]
[0096] 由表6可知，室内盆栽试验中，筛选出的菌株ZBL-1对棉花黄萎病的防治效果为 73.0%，盆栽效果参见附图5,可知甲基营养型芽孢杆菌ZBL-1对棉花黄萎病具有较好的防 治效果。
[0097] 实施例七、甲基营养型芽抱杆菌（Baci 1 lus methylotrophicus)ZBL-1CGMCC No. 11636对棉花黄萎病的田间防效
[0098] 采用田间试验法测定甲基营养型芽孢杆菌ZBL-1对大丽轮枝菌的拮抗，具体步骤 如下：
[0099] (1)将ZBL-1在LB培养液中28°C振荡过夜培养2d，稀释至浓度为109cfu/ml，在棉花 黄萎病发生初期6月1号、6月5日、6月10日连续开沟灌施三次，每株棉花每次灌施500ml培养 液，作为试验组。
[01 00] (2)以50 %多菌灵1000倍作为药剂对照，设空白清水对照，每小区面积为10m2，每 处理三个重复，病情指数计算公式参照实施例六，结果取平均值。
[0101] 试验田为自然病圃，发病严重、均匀;记载施药前病情指数，三次药后7d、14d、调查 病情指数，统计防治效果。在表7中对照组是清水对照，多菌灵组和ZBL-1组是处理组。
[0102] 表7ZBL-1对棉花黄萎病的田间防治效果
[0103]
[0104]由表7可知，在田间小区实验中，甲基营养型芽孢杆菌ZBL-1菌液对棉花黄萎病有 一定的防治效果，药后7d的防治效果为32.4%，药后14d为43.1%，均高于多菌灵处理的防 治效果，具有开发价值。
[0105]上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非对实施方式的限定。 对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化 或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所延伸出的显而易见的变化 或变动仍处于本发明的保护范围之中。
【主权项】
1. 一种甲基营养型芽孢杆菌(Bacillusmethylotrophicus)ZBL-1，其特征在于，所述 的甲基营养型芽孢杆菌（Bacillusmethylotrophicus)ZBL-1的CGMCC保藏号为No. 11636。2. 如权利要求1所述甲基营养型芽孢杆菌(Bacillusmethylotrophicus)ZBL-1在防 治棉花黄萎病中应用。
【专利摘要】本发明公开一种甲基营养型芽孢杆菌ZBL-1在防治棉花黄萎病中应用，通过在石河子市重病棉田地区采集的土壤样品中分离、筛选、选育、驯化，获得一株对大丽轮枝菌有较高抑制效果的甲基营养型芽孢杆菌(<i>Bacillus？methylotrophicus</i>)？ZBL-1？CGMCC？No.11636，与常见的甲基营养型芽孢杆菌菌株存在明显不同，同时，利用筛选出的菌株ZBL-1对在室内盆栽试验中对棉花黄萎病的防治效果为73.0%；在田间小区实验中其防治效果为43.1%，作为棉花黄萎病的生物防治材料，无论开发新的生物农药或者生物防治菌剂，该菌都具有很好的应用前景，具有现实的意义和作用。CGMCC No. 1163620151109
【IPC分类】C12R1/07, C12N1/20, A01N63/00, A61P3/00
【公开号】CN105441366
【申请号】CN201511032289
【发明人】刘海洋, 姚举, 王 琦, 史应武, 王伟, 张仁福, 李春, 韩万里
【申请人】中国农业大学, 新疆农业科学院植物保护研究所
【公开日】2016年3月30日
【申请日】2015年12月31日