y2QQh, 13, 6795-6802 ;5、Bolea, R. ei. ifeoi β?·. 2011, 54, 8251-8270。其中，对于 &或 R2为0(CH2)nNR5R6时的苯甲醛类化合物（1)或2-羟基苯乙酮类化合物（2)的制备，可按照 文献（YongD.，eiaA CV 201310054592.0)所报道方法，用相应的含酚羟基的化合物先 与相应的二溴化物反应，所得单溴化物再与HNR5R 6经烷基化反应即得。
[0010] 按照上述方法所得之2-羟基查尔酮类化合物（I)分子中含有氨基，该氨基呈碱 性，可与任何合适的酸通过药学上常规的成盐方法制得其药物学上可接受的盐，所述的酸 为：盐酸、氢溴酸、硝酸、硫酸、磷酸、c 16脂肪羧酸(如：甲酸、乙酸、丙酸等)、草酸、苯甲酸、 水杨酸、马来酸、富马酸、琥珀酸、酒石酸、柠檬酸、苹果酸、硫辛酸、c 16烷基磺酸(如：甲基磺 酸、乙基磺酸等)、樟脑磺酸、苯磺酸或对甲苯磺酸。
[0011] 本发明所公开的药物组合物包括治疗有效量的一种或多种2-羟基查尔酮类化合 物（I)或其药学上可接受的盐，该药物组合物可进一步含有一种或多种药学上可接受的载 体或赋形剂。所述"治疗有效量"是指引起研究者或医生所针对的组织、系统或动物的生物 或医药反应的药物或药剂的量；所述"组合物"是指通过将一种以上物质或组份混和而成的 产品；所述"药学上可接受的载体"是指药学上可接受的物质、组合物或载体，如：液体或固 体填充剂、稀释剂、赋形剂、溶剂或包囊物质，它们携带或转运某种化学物质。本发明所提供 的药物组合物其理想的比例是，2-羟基查尔酮类化合物（I)或其药学上可接受的盐作为活 性成分占总重量比5%~99. 5%，其余部分为占总重量比95%以下。
[0012] 本发明所公开的2-羟基查尔酮类化合物（I)及其药学上可接受的盐进行了如下 的生物活性筛选。
[0013] (1) 2-羟基查尔酮类化合物（I)对Αβ i 42自身聚集的抑制活性 参照文献（Qiang, X.M. eiaZ 及/r. /ifeoi β?·. 2014，76，314-331)所报道的方 法进行测定，即：预处理后的A，i 42用DMS0配成储备液，使用前用ρΗ7. 4的PBS缓冲液稀 释至5〇μΜ ;待测化合物用DMS0配成2. 5 mM储备液，使用前用pH7. 4的PBS缓冲液稀释至 相应浓度，取2〇μL的A，i 42溶液+2〇μL的待测化合物溶液、20 μ L的A，i 42溶液+2〇μL的 PBS缓冲液(含2%DMS0)于96孔板中，37°C孵育24h，然后加入16〇μL含有5μΜ硫黄素 Τ的 50mM的甘氨酸-NaOH缓冲液（ρΗ=8. 5)，振摇5s后立即用多功能酶标仪在446 nm激发波长 和490 nm发射波长下测定荧光值；A，i 42+待测化合物的荧光值记为迅，A，i 42+PBS缓冲 液的荧光值记为IF。，只含有PBS缓冲液的荧光值记为IF。，化合物抑制A，i 42自身聚集的抑 制率为：100- (IF^IF。) AI^-IF。) *100 ;选择化合物的五至六个浓度，测定其抑制率，并以 该化合物摩尔浓度的负对数与相应的抑制率线性回归，求得50%抑制率时的摩尔浓度即为 该化合物的IC 5。值；每个化合物每个浓度复测三次，以姜黄素为阳性对照。测定结果表明， 本发明实施例中所公开的2-羟基查尔酮类化合物（I)对Αβ i 42自身聚集均具有显著抑制 活性，其IC5。为0. 2 μΜ~10.0 μΜ，阳性药姜黄素的IC5。约为35. 5 μΜ;而广泛使用的抗AD药 物：多奈哌齐、卡巴拉汀、盐酸美金刚胺等以及本申请中化合物（I)的母核--2-羟基查尔 酮（RfRpH)在25. 0 μΜ浓度下对Α β i 42自身聚集的抑制率均小于5%。
[0014] (2) 2-羟基查尔酮类化合物（I)与金属离子络合作用的测定 用甲醇溶解CuCl2 · 2H20、ZnCl2、FeS04 · 7H20、A1C13及待测化合物，配成75Mmol/L的 溶液，向96孔板中加入10〇μL待测化合物溶液和10〇μL金属离子溶液，混匀，室温静置30 min，在Varioskan Flash Multimode Reader仪上记录混合物在200-600 nm范围内的紫外 吸收曲线，并以ιοομL待测化合物溶液和ιοομL甲醇混合液为对照，观察金属离子与待测化 合物混合液的最大吸收峰的红移现象及最大吸收峰的强度。测定结果表明，本发明实施例 中所公开的2-羟基查尔酮类化合物（I)均表现出对金属离子有强络合作用。
[0015] (3) 2-羟基查尔酮类化合物（I)对Cu2+诱导的Αβ i 42聚集的抑制活性 将CuCl2用HEPES缓冲液配成75μΜ溶液，用HEPES缓冲液将化合物储备液（2. 5 mM) 和20〇μΜ的A，i 42储备液稀释至75μΜ，分别取2〇μL Cu2+溶液+2〇μL A，i 42溶液+2〇μL待 测化合物溶液、2〇μL Cu2+溶液+2〇μL Α々142溶液+2〇μL HEPES缓冲液以及6〇μL HEPES缓 冲液于96孔板中，混匀，37°C孵育24 h，然后加入19〇μL含有5μΜ硫黄素 T的50mM的甘氨 酸-NaOH缓冲液（pH=8. 5)，振摇5s后立即用多功能酶标仪在446nm激发波长和490nm发 射波长下测定荧光值；Cu2++A，i 42+待测化合物的荧光值记录为IFy Cu2++A，i 42+HEPES缓 冲液的荧光值记录为IF。，只含有HEPES缓冲液的荧光值记录为IF。，化合物对Cu 2+诱导的 42聚集的抑制率为Ηοο-αρ^π^να^-π^Φ?οο。每个化合物每个浓度测定三个复 孔，以姜黄素为阳性对照。测定结果表明，本发明实施例中所公开的2-羟基查尔酮类化合 物（I)在25. Ο μΜ浓度下对Cu2+诱导的Αβ i 42聚集的抑制率均大于85. 0%，而姜黄素在相 同浓度下的抑制率为54. 0%，化合物（I)的母核--2-羟基查尔酮（RfRfH)在相同浓度下 的抑制率小于10. 0%。
[0016] (4) 2-羟基查尔酮类化合物（I)对Cu2+诱导的Αβ i 42聚集的解聚活性 取2〇μL Cu2+溶液+2〇μL i 42溶液于96孔板中，37°C孵育24h，加入2〇μL待测化合物 溶液（Cu'A/^ 42和待测化合物的最终浓度均为25μΜ)，在37°C再孵育24h，然后加入19〇μL 含有5μΜ硫黄素 Τ的50 mM的甘氨酸-NaOH缓冲液（ρΗ=8. 5)，振摇5s后立即用多功能酶标 仪在446 nm激发波长和490 nm发射波长下测定荧光值；以ρΗ=6·6的HEPES缓冲液（20 mM) 为参比，Cu2++A，i 42+待测化合物的荧光值记录为IFyCi^+AP i 42+HEPES缓冲液的荧光值记 录为IF。，化合物对Cu2+诱导的AA 42聚集的解聚率的计算公式为：100-(巩)八1匕)*100。 每个化合物每个浓度测定三个复孔，以姜黄素为阳性对照。测定结果表明，本发明实施例中 所公开的2-羟基查尔酮类化合物（I)在25. 0 μΜ浓度下对Cu2+诱导的Αβ 1 42聚集的解聚 率均大于70. 0%，姜黄素在相同浓度下的解聚率为56. 5%，而化合物（I)的母核化合物-- 2-羟基查尔酮（RfRfH)在相同浓度下的解聚率小于10. 0%。
[0017] (5) 2-羟基查尔酮类化合物（I)的抗氧化活性（0RAC-FL方法） 参照文献（Qiang, X.E /ifeoi fife?. 2014，76，314-331)所报道的方法 进行测定，即：6_羟基-2, 5, 7, 8-四甲基色烷-2-羧酸（rrohx)用pH7. 4的PBS缓冲液配成 l〇-8〇Mmol/L的溶液，突光素（fluorescein)用pH7. 4的PBS缓冲液配成250nmol/L的溶液， 2, 2' -偶氮二异丁基脒二盐酸盐（AAPH)使用前用pH7. 4的PBS缓冲液配成40mmol/L的溶 液。向96孔板中加入50-10Mmol/L的化合物溶液和荧光素溶液，混匀，37°C孵育15min，加 入AAPH溶液，使每孔总体积为20〇KL，混匀，立即置于Varioskan Flash Multimode Reader 仪中，在485 nm激发波长和535 nm发射波长下连续测定90min。计算出突光衰减曲线下面 积AUC，其中以l-8Mmol/L的作为标准，以不加待测样品为空白，化合物的抗氧化活 性结果表达为的当量，其计算公式为：[(AUC Sample-AUC blankV(AUC 7>Wox-AUC blank)] X [(concentration of 7>c^ay/concentration of sample)]，每个化合物每次测 定3个复孔，每组实验独立重复三次。测定结果表明，本发明实施例中所公开的2-羟基查 尔酮类化合物（I)的抗氧化活性为的1. 0-5. 0倍，说明该类化合物具有强抗氧化活 性。
[0018] (6)乙酰胆碱酯酶和丁酰胆碱酯酶抑制活性 向96孔板中依次加入1. 0 mmol/L碘化硫代乙酰胆碱或碘化硫代丁酰胆碱(均购自 Sigma公司）3〇μL、ρΗ7· 4的PBS缓冲液4〇μL、待测化合物溶液2〇μL (D