.5倍混合均匀，使混合后的三七药材粉末中含水量 达到60%。取混合后的三七药材粉末每50g分装于500ml的倒三角瓶中，擦拭瓶口，用棉塞封 住瓶口，用牛皮纸包扎，标注日期、操作者。置于立式压力蒸汽灭菌器中灭菌处理1小时。待 灭菌结束后，于室温下冷却，在无菌操作台内接入种子液，于29~31°C，65%RH条件下避光 培养，至容器底部布满菌丝体为止，取出干燥，即得三七转化产物。
[0057]步骤二:提取
[0058]取三七转化产物干品5.0kg，加入8倍量70 %的乙醇加热回流提取4次，每次2小时， 过滤，合并提取液，减压浓缩得稠膏。将稠膏用适量水混悬分散，依次用等体积的石油醚、乙 酸乙酯、水饱和正丁醇溶液各萃取6次，萃取液分别减压干燥得石油醚部分14g，乙酸乙酯部 分50g，水饱和正丁醇部分400g。
[0059] 步骤三:分离纯化
[0060] 取乙酸乙酯部分干膏45g上硅胶柱层析色谱，以体积比100:0~0:100的二氯甲烷-甲醇混合溶剂洗脱，薄层色谱检识，收集二氯甲烷-甲醇= 100:10部分洗脱液，合并含所述 三萜皂苷类化合物流分为157~165的洗脱液，回收溶剂至干，所得物再经反相RP-C18柱层 析，以体积比100:50的甲醇-水混合溶剂洗脱，减压回收溶剂至干，得到含有所述三萜皂苷 类化合物粗品，再经半制备型高效液相色谱分离纯化，用58%甲醇-水洗脱，即为甲醇与水 的重量分数比为58:42，得到所述三萜皂苷类化合物纯品6. lmg。
[0061 ]所得新化合物物理化学常数如下：
[0062] 白色粉末（甲醇），ESI-MS:m/z 677.42([M+Na] + )，m/z 689.40([M+C1] -)。10%硫酸 乙醇溶液显紫红色，Mo 1 i sh反应阳性，L i eb ermann-Bur char d反应阳性。
[0063] 鉴定:采用化学方法，气相色谱分析及波谱学等方法进行结构鉴定。
[0064] 1.0m〇l/L盐酸水解，加入L-半胱氨酸甲酯盐酸及1-三甲基硅烷基-1H-咪唑得到葡 萄糖衍生物，经正己烷萃取后，如图5和图6所示，采用GC色谱分析检出β-D-葡萄糖。
[0065] 如图1所示，根据h-NMR (CD30D，500MHz)高场区给出7个甲基单峰信号，给出一个糖 的端基质子信号。
[0066] 如图2所示，根据13C-NMR(CD30D，125MHz)谱中给出36个碳原子信号，高场区给出7 个甲基单峰信号，低场区给出一对烯烃信号和一个羰基碳信号，中场区给出一组葡萄糖信 号。
[0067] 如图3和图4所示，通过解析化合物的HMQC谱及HMBC谱可知一分子葡萄糖与C-6位 成苷，同时给出化合物的侧链连接关系。
[0068] 化合物的1H-NMR、13C-NMR数据归属见上表1所示。
[0069] 实施例2:本发明化合物抗肿瘤活性试验
[0070] 一、试验材料
[0071] 1、体外试验瘤株：
[0072] Helas人宫颈癌细胞，由长春中医药大学研发中心药理实验室提供。
[0073] 2、体外试验用试剂：
[0074] 新生牛血清，二甲基亚砜(DMS0)及MTT四哇盐(Sigma公司）。
[0075] 3、体外试验用仪器：
[0076] 酶标仪:Multiskan Ascent，型号：VL.23354-00541T。
[0077] 二、试验方法
[0078] MTT液的配制：取250mgMTT，放入小烧杯中，加入50mlPBS(pH 7 · 4，0 · 01M)，搅拌 30min，配制成浓度为5mg/ml溶液，用0.22um的微孔滤器滤菌，分装，4°C保存，两周内有效。
[0079]取对数生长期的肿瘤细胞，加入适量0.25 %胰蛋白酶，使贴壁细胞脱落，作细胞计 数，一般不着色的活细胞应在97 %以上，配成6 X 104/ml细胞悬液。取96孔平板，每孔加细胞 悬液100ul，将平板置37°C5%C02温箱24h。孵育24h后，于96孔板加入100ul/孔不同浓度的 待测化合物溶液。于96孔板每孔加入20ul MTT液，继续孵育4h，终止培养。小心吸取上清液， 每孔加入150ulDMS0溶液，震荡溶解，用自动化分光光度平板读数计在570nm处测定每个小 孔的光密度值。
[0080]试验结果表明，化合物人参皂苷ST-8对Helas人宫颈癌细胞具有一定的杀伤作用， 结果见表2所示。
[0081 ] 表2人参皂苷ST-8对Helas人宫颈癌细胞的影响。
[0082]
[0083]本发明提供了一种新的三萜皂苷类化合物；三萜皂苷类化合物的制备方法和用 途，并运用体外抗肿瘤活性筛选体系对此新的三萜皂苷类化合物进行活性评价，结果表明， 所述的化合物具有较好的抗肿瘤作用。经过体外抗肿瘤活性试验，表明具有明显的抗肿瘤 活性，为制备抗肿瘤药物提供了新的来源。
[0084]本文虽然已经给出了本发明的一些实施例，但是本领域的技术人员应当理解，在 不脱离本发明精神的情况下，可以对本文的实施例进行改变。上述实施例只是示例性的，不 应以本文的实施例作为本发明权利范围的限定。
【主权项】
1. 三萜皂苷类化合物，其特征在于，所述三萜皂苷类化合物的结构式为：所述三萜皂苷类化合物为:6-(H3-D-吡喃葡萄糖基-达玛-17β(Η)-20(22)(Ε)-烯-3β，6 a，120，24S，25_ 五醇。2. 如权利要求1所述的三萜皂苷类化合物，其特征在于，所述的三萜皂苷类化合物是从 三七转化产物中提取得到的。3. -种如权利要求1所述的三萜皂苷类化合物的制备方法，其特征在于，具体步骤如 下： 步骤一:三七转化产物的制备： A种子液制备： 取灵芝种子培养液液体培养基于压力蒸汽灭菌器中于121°C灭菌处理30分钟，冷却后 在无菌操作台中接入斜面菌种，于恒温振荡培养箱中于27~29°C，160转/分钟下培养，得澄 清星芒状菌球，即得种子液备用； B转化产物的制备： 取三七药材粉末，加入生长因子和水，混匀，密封并灭菌，于室温下冷却，在无菌操作台 内接入所述步骤A制备的所述种子液，避光培养，至容器底部布满菌丝体为止，取出干燥，即 得三七转化产物； 步骤二:提取： 取所述步骤B制备的所述三七转化产物，加入4~8倍重量份的70 %的乙醇，回流提取3 ~5次，每次1~3小时，过滤并合并提取液，压缩得稠膏;将所述稠膏加水分散并依次用等体 积的石油醚、乙酸乙酯、水饱和正丁醇溶液萃取6~8次，后对萃取液分别减压干燥，得石油 醚部分、乙酸乙酯部分和水饱和正丁醇部分； 步骤三:分离纯化： 取所述步骤二制备的所述乙酸乙酯部分上硅胶柱色谱，以体积比1〇〇:〇~〇:1〇〇的二氯 甲烷-甲醇混合溶剂洗脱，薄层色谱检识，收集二氯甲烷-甲醇= 100:10部分洗脱液，合并含 所述三萜皂苷类化合物所述流分为157~165的洗脱液，回收溶剂至干，所得物再经反相RP-C18柱层析，以体积比100:50的甲醇-水混合溶剂洗脱，减压回收溶剂至干，得到含有所述三 萜皂苷类化合物粗品，再经半制备型高效液相色谱分离纯化，用58%甲醇-水洗脱，即甲醇 与水的质量比为58:42，得到所述三萜皂苷类化合物纯品。4. 如权利要求3所述的三萜皂苷类化合物的制备方法，其特征在于，所述灵芝种子培养 液液体培养基包括如下重量百分比的组分:葡萄糖为1%~4%，蛋白胨为0.2%~1%，酵母 粉为0.1 %~0.3 %，磷酸二氢钾为0.1 %~0.3 %，硫酸镁为0.1 %，水为95 %~99 %。5. 如权利要求4所述的三萜皂苷类化合物的制备方法，其特征在于，所述灵芝种子培养 液液体培养基包括如下重量百分比的组分:葡萄糖为2%，蛋白胨为0.5%，酵母粉为0.2%， 磷酸二氢钾为〇. 1%，硫酸镁为〇. 1%，水为97.1%。6. 如权利要求5所述的三萜皂苷类化合物的制备方法，其特征在于，所述步骤B中：所述 三七药材粉末过10目筛;所述生长因子为:碳酸钙，加入的所述碳酸钙的重量为所述三七药 材粉末重量的0.01倍量，加水量为所述三七药材粉末重量的1.5倍;所述混均后的三七药材 粉末中含水量为60 %。7. 如权利要求6所述的三萜皂苷类化合物的制备方法，其特征在于，所述步骤B中：灭菌 条件为:于立式压力蒸汽灭菌器中灭菌处理1小时;避光培养条件为:29°C~31°C，65%RH。8. 如权利要求7所述的三萜皂苷类化合物的制备方法，其特征在于，所述步骤B中，灵芝 种子液与所述三七药材的重量体比为2:1。9. 如权利要求1所述的三萜类化合物的用途，其特征在于，所述三萜皂苷类化合物在制 备抗肿瘤药物中的应用。10. -种抗肿瘤药物，其特征在于，包含权利要求1所述的三萜皂苷类化合物。
【专利摘要】本发明属于医药技术领域，公开了三萜皂苷类化合物及其制备方法和用途，所述三萜皂苷类化合物为：6-O-β-D-吡喃葡萄糖基-达玛-17β(H)-20(22)(E)–烯-3β,6α,12β,24S,25-五醇，其结构式为：本发明采用质谱和一维、二维核磁共振波谱技术，以及化学方法确定三萜皂苷类化合物的化学结构。经过体外抗肿瘤活性试验，表明具有明显的抗肿瘤活性，为制备抗肿瘤药物提供了新的来源。
【IPC分类】C07J17/00, C12P33/20, A61P35/00, A61K31/704, C12R1/645
【公开号】CN105481930
【申请号】CN201510498025
【发明人】邱智东, 徐伟
【申请人】长春中医药大学
【公开日】2016年4月13日
【申请日】2015年8月14日