作为猪繁殖与呼吸综合征病毒疫苗抗原的靶细胞特异性融合蛋白和疫苗组合物的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及具备诱发猪体内产生猪繁殖与呼吸综合征病毒的细胞免疫及中和抗 体反应的靶细胞特异性融合蛋白亚单位疫苗。
【背景技术】
[0002] 猪繁殖与呼吸综合征（porcine reproductive and respiratory syndrome， PRRS)是一种由猪繁殖与呼吸综合征病毒（porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)感染后导致母猪繁殖障碍，并对不同日龄猪以呼吸道感染为主的 急性传染病。该病毒为单股正链RNA病毒，其容易感染T-细胞、树突细胞、单核细胞或巨噬细 胞。猪群一旦受PRRSV感染后，会破坏其肺泡巨细胞(porcine alveolar macrophages， PAMs)和肺血管内巨·细胞（pulmonary intravascular macrophages，PIMs)，从而造成巨 噬细胞的数量减少，减弱宿主免疫系统并增加机会性病原入侵宿主的机会;此外，受感染的 单核细胞和巨噬细胞可携带病毒扩散至各个器官，并透过感染的单核细胞经由乳汁或精液 将病毒传给哺乳仔猪与配种母猪，以垂直及平行传染的方式扩散病毒传播。
[0003] PRRSV能诱导感染猪周边血液单核细胞(peripheral blood mononuclear cells， PBMCs)的抗发炎细胞激素 IL-10基因表现量显着上升。显示PRRSV可能经由诱导IL-10基因 表现来抑制炎症反应，使感染猪更容易遭到二次感染而造成更严重的损失。另有研究指出 于PRRSV感染细胞前先投予IFN-γ，能有效抑制PRRSV的复制，且抑制效果与投予剂量有正 相关性，若改投予猪IL-12重组蛋白，亦有类似结果，同时还发现IFN-γ被大量诱导而IL-10 却相对减少。由此显示IL-12可加强抗原特异性细胞免疫并促进Thl免疫反应，产生大量的 IFN-γ及抑制IL-10产生来拮抗PRRSV的感染与复制。MLV疫苗(Modified Live Virus，MLV) 已被证实疫苗产生的细胞免疫反应与保护力是具有关联性的，而且疫苗的保护力并非依靠 体液免疫反应所产生的抗体;反而仰赖是细胞免疫反应所诱发的IFN- γ。
[0004] 虽然市面上已有PRRSV疫苗销售，但有研究报告表明某些疫苗免疫计划完整的猪 场仍会爆发PRRS疫情，显示出现有疫苗可能无法提供交叉保护力以抵抗PRRSV野毒株的感 染。此外，PRRSV又有抗体依赖性增强作用(antibody dependent enhancement，ADE)的现象 存在，使得传统灭活疫苗产生的非中和性抗体非但无保护效果反而使感染更加剧而引发更 严重的感染，通常被PRRSV感染的动物无明显症状，但被感染动物的免疫力降低而容易造成 二次感染，导致生产性能下降与死亡率升高。
[0005] 目前虽然已有PRRSV的减毒活疫苗问世，然而因 PRRSV为一种RNA病毒，减毒活疫 苗效力常随着野毒株的突变而失去保护效力。因为PRRSV易破坏宿主免疫系统的特性，而现 行疫苗又无法安全有效且稳定的控制疫情，所以减少发生ADE效应以提升抗体保护力与细 胞免疫反应是未来PRRSV疫苗的开发重点。
【发明内容】
[0006] [要解决的技术问题]
[0007] 本发明的目的是解决上述现有技术存在的问题，提供一种作为猪繁殖与呼吸综合 征病毒疫苗抗原的靶细胞特异性融合蛋白和疫苗组合物及其应用。
[0008] [技术方案]
[0009] 为了达到上述的技术效果，本发明采取以下技术方案：
[0010] -种作为猪繁殖与呼吸综合征病毒疫苗抗原的靶细胞特异性融合蛋白，该靶细胞 特异性融合蛋白的氨基酸序列包括以下序列：
[0011] (a)N_端酶结构域缺失之博得特氏菌的腺苷酸环化酶的氨基酸序列；
[0012] (b)抗原的氨基酸序列，其氨基酸序列是由
[0013] 序列I:猪繁殖与呼吸综合征病毒的核蛋白部分序列，相应于第65~123氨基酸、
[0014] 序列Π :北美株猪繁殖与呼吸综合征病毒的膜蛋白M protein部分序列，相应于第 2~26氨基酸、
[0015] 序列m:北美株猪繁殖与呼吸综合征病毒的膜蛋白GP5部分序列，相应于第31-63 氨基酸、
[0016] 其中，所述抗原的氨基酸序列位于所述N-端酶结构域缺失之博得特氏菌的腺苷酸 环化酶的氨基酸序列的N-端。
[0017] 本发明更进一步的技术方案，所述抗原的氨基酸序列还包括：
[0018] 序列IV:猪繁殖与呼吸综合征病毒的核酸复制酶部分序列，相应于第1049-1213氨 基酸。
[0019] 本发明更进一步的技术方案，所述抗原的氨基酸序列还包括：
[0020] 序列V :欧洲株猪繁殖与呼吸综合征病毒的膜蛋白M protein部分序列，相应于第 1-28氨基酸、
[0021] 序列VI:欧洲株猪繁殖与呼吸综合征病毒的膜蛋白GP5部分序列所组成，相应于第 31-64氨基酸。
[0022] 本发明更进一步的技术方案，所述N-端酶结构域缺失之博得特氏菌的腺苷酸环化 酶的氨基酸序列如SEQ ID N0:1。
[0023] 本发明更进一步的技术方案，所述抗原的氨基酸序列是由序列I~序列VI组成，其 氨基酸序列如SEQ ID N0:2。
[0024] -种疫苗组合物，该疫苗组合物包括上述所述的作为猪繁殖与呼吸综合征病毒疫 苗抗原的靶细胞特异性融合蛋白，还包括免疫学和药学上接受的载体或佐剂。
[0025] 本发明更进一步的技术方案，所述免疫学和药学上接受的载体为通过疏水非共价 相互作用结合多肽的聚合物或共价结合多肽的聚合物。
[0026] 本发明更进一步的技术方案，所述佐剂为溴化二甲基双十八烷基铵、氢氧化铝、弗 氏不完全佐剂、单磷酰基脂A、海藻糖二霉菌酸酯、海藻糖二山嵛酸酯、胞壁酰基二肽、 ISA201佐剂或ISA206佐剂。
[0027] 本发明更进一步的技术方案，所述疫苗组合物用于引发动物体内免疫应答以对抗 PRRSV感染。
[0028] 本发明更进一步的技术方案，与所述抗原的氨基酸序列向对应的核酸序列，是通 过化学方法进行全基因合成得到的。
[0029] 下面将详细地说明本发明。
[0030] 本发明中，由于博得特氏菌的腺苷酸环化酶是一种毒素，它是双官能蛋白，其包括 N-端的催化区和C-端，对博得特氏菌的腺苷酸环化酶N-端酶结构域缺失，可合成一种无活 性的原毒素。本发明中使用的腺苷酸环化酶的氨基酸序列保留了C-端的作用，即所述N-端 酶结构域缺失之博得特氏菌的腺苷酸环化酶的氨基酸序列作用于将插入到该氨基酸序列 N-端的抗原多肽即所述的靶细胞特异性融合蛋白向细胞胞质溶胶内的转运。并且为了将该 氨基酸序列的对应核酸序列插入到质粒中，本发明对所述N-端酶结构域缺失之博得特氏菌 的腺苷酸环化酶的核酸序列(6 6他&1^核酸序列数据库登录码第60370813号第1114~5121 核酸序列）的5 '端和3 '端分别引入了ΚρηΙ位点和Nhel位点，得到BPAC核酸序列如SEQ ID N0:5。根据选择的质粒的不同，可以向5'端和3'端分别引入不同的酶切位点，而不仅限于上 述的酶切位点。
[0031] 本发明优选质粒pAmp-LacZ作为革E1细胞特异性融合蛋白的重组表现质粒，其核酸 序列如SEQ ID N0:13。亦可选择pKan-LacI作为靶细胞特异性融合蛋白的重组表现质粒，其 核酸序列如SEQ ID N0:17。
[0032] 为了保证本发明靶细胞特异性融合蛋白制备的疫苗组合物免疫接种后，能针对几 乎所有猪繁殖与呼吸综合征病毒的免疫应答，而选择序列I:猪繁殖与呼吸综合征病毒的核 蛋白部分序列(GenBank氨基酸序列数据库登录码第AAC98536号），选取C-端序列转换成合 适于大肠杆菌寄主系统中表现的对应核酸序列如SEQ ID N0:7;保守型较高的序列Π :北美 株猪繁殖与呼吸综合征病毒的膜蛋白M protein部分序列(GenBank氨基酸序列数据库登录 码第AIP91957号），选取N-端序列转换成合适大肠杆菌寄主系统中表现的对应核酸序列如 SEQ ID N0:8;序列ΙΠ :北美株猪繁殖与呼吸综合征病毒的膜蛋白GP5部分序列(GenBank氨 基酸序列数据库登录码第ACG50943号），选取N-端序列转换成合适大肠杆菌寄主系统中表 现的对应核酸序列如SEQ ID N0:9作为抗原多肽的核酸序列。
[0033]更进一步的，由于PPRSV分为北美株和欧洲株，因此为了保证本发明靶细胞特异性 融合蛋白制备的疫苗组合物免疫接种后，产生针对所有北美株和欧洲株病毒的免疫应答， 本发明在膜蛋白M protein和膜蛋白GP5基因序列的选择上，选择了相对北美株和欧洲株两 种病毒株来说较保守的基因序列。本发明进一步选用了以下组合:序列I:猪繁殖与呼吸综 合