Bartel B(2001)A library of Arabidopsis 35S_cDNA lines for identifying novel mutants.Plant Mol Biol 46:695-703.)上的目的基因用前期克隆得到的AtIAA17基因替换而来。为完成此目的，首先 用Smal酶切克隆的AtIAA17基因片段，同时用Smal酶切pBARN质粒。酶切反应在30度培养箱 中进行，约4-6个小时之后，用1% (质量体积比)琼脂糖胶电泳检测。将酶切后的AtIAA17基 因片段和pBARN质粒上切下的大片段用DNA凝胶回收试剂盒(前面已述）回收。把AtIAA17基 因片段比pBARN质粒载体片段按3:1(摩尔浓度比）的比例混合样品，加入T4 DNA连接酶5个 单位，10 X反应缓冲液，无菌水补充体积至20yL，16°C连接过夜。用冻融法转化大肠杆菌 DH5a，在含有卡拉霉素50yg/mL的LB固体(配方如下：分别称取10克胰蛋白胨，5克酵母提取 物和10克氯化钠，8克琼脂依次溶解于蒸馏水中，定容于1000毫升。分装于500毫升三角瓶 中，121°C，6.859X104Pa下高压消毒15分钟。4°C冷藏备用)平板上筛选，挑斑做菌落PCR，以 及提质粒，酶切验证正确的重组质粒命名为35SpBARN-AtIAA17,并对获得的载体进行序列 测定，分析结果，获得了一种分离的基因，其序列为SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。载体结 构如图1所示。
[0029] 然后利用冻融法（前面已述）将35SpBARN-AtIAA17转入根癌农杆菌GV3101(Yang LX,Wang RY,Ren F,Liu J,Cheng J,Lu YT(2005)AtGLBl enhances the tolerance of Arabidopsis to hydrogen peroxide stress.Plant Cell Physiol 46:1309-1316·)，涂 布于含有50yg/mL卡那霉素和利福平(50yg/mL)的LB固体(配方如下：分别称取10克胰蛋白 胨，5克酵母提取物和10克氯化钠，8克琼脂依次溶解于蒸馏水中，定容于1000毫升。分装于 500毫升三角瓶中，121°(3,6.859\104? &下高压消毒15分钟。4°(3冷藏备用）平板上，37°(3培 养过夜，各挑选白斑三个，做菌落PCR检测。
[0030] 本发明所使用的研究AtIAA17基因功能的重组植物表达载体，含有所述AtIAA17基 因的编码区核苷酸序列，组成型35S启动子(CaMV35S)可以增强AtIAA17基因的表达水平。该 载体大小适合，在植物中易与转化，所带有的除草剂抗性标容易检测。通过这个载体转化拟 南芥可以获得抗病增强的拟南芥转基因植株。
[0031] 2、AtIAA17基因超表达载体(35SpBARN-AtIAA17)的遗传转化：
[0032] 参照文献中的方法进行拟南芥转化(Zhang X.R.et al .Agrobacteriym-mediated transformation of Arabidopsis thaliana using the floral dip method. Nature, 2006,1:1-6)。制备含有构建好载体的根癌农杆菌GV3101(Yang LX，Wang RY，Ren F，Liu J， Cheng J,Lu YT(2005)AtGLBl enhances the tolerance of Arabidopsis to hydrogen peroxide stress.Plant Cell Physiol 46:1309-1316.)菌液，在转化前一天转入含有卡 那霉素50μg/ml、利福平50μg/ml的LB液体培养基中，28°C过夜培养。第二天，用紫外分光光 度计(SPEK0L 1300)于276nm纳米波长下检测的吸光值，当菌液的吸光值达到在1.6-2.0之 间时取出。室温（20-25°C，以下相同）以4000g离心10min，弃上清，将沉淀悬浮于等体积的 5 %蔗糖（质量体积比）中。将浑浊的蔗糖溶液倒入一大培养皿中，转化前加入终浓度为 0.02 % (体积比）的Si lwet L-77 (购自北京五洲元业科贸中心，以下相同）。混匀后把待转化 的拟南芥整个花序轻轻的浸没在蔗糖中，默数15s，取出植株。转化后的植株用一个黑色塑 料袋包好，放在生长箱培养。第二天将塑料袋揭开，放在光强的地方培养。培养一个月左右 收获种子，种子在培养箱或者日光下干燥3-5天。将转化收获的T0代种子播在混有营养液的 蛭石中（营养液成份为：每升含5ml lMKN〇3,2ml lMCa(N〇3)2,4H20,2ml lMMgS〇4*7H20， 2.5ml 20mMFe.EDTA，2.5ml 1M磷酸缓冲液(pH5.5)，lml MS微量元素）；4°C春化一星期， 在21-22°C的生长间中自然生长两星期左右，待到达四叶期的早期进行除草剂(50μg/ml)的 喷洒第一次，一星期之后进行第二次喷洒。两次喷洒后对存活的绿苗进行PCR阳性检测，获 得拟南芥转基因阳性苗。
[0033]根据以上除草剂(50μg/ml)喷洒筛选，转基因 T1代(第一代)植株在苗期(播种后10 天），得到成活植株。在液氮中将植物幼嫩叶片样品研磨至粉状，利用Trirol提取试剂盒(购 自Invitrogen公司，以下相同）的要求进行RNA的提取。提取的总RNA溶于无 RNase的双蒸水 中。DNase I(购自Promega公司，以下相同）去除可能残留的DNA。用蛋白检测仪(DM 650 BECKMAN，MSA)分别检测RNA在260纳米和280纳米光吸收值，结合1 % (质量体积比）琼脂糖 凝胶电泳鉴定RNA的纯度及浓度。以获得的RNA为模板进行逆转录，得到的cDNA分装后于-20 °〇保存备用。根据表达载体上外源AtIAA17基因序列，设计引物进行PCR检测（序列为 IAA17F: 5 ' -GAAGGTATCAATGGACGGAGCA-3 '，IAA17R: 5 ' -CCGACGAGCATCCAATCACC-3 '），将经过 PCR检测的阳性植株编号并标记。
[0034]根据获得的上述核苷酸序列（SEQ ID No.l)，通过构建AtIAA17超表达植物重组载 体(35SpBARN-AtIAA17)，转化拟南芥，申请人获得AtIAA17基因显著升高的转基因拟南芥 (请见图2)。
[0035] 实施例3:AtIAA17基因在增强拟南芥对病原菌Pst DC3000抗性中的应用
[0036] A、将拟南芥35SpBARN-AtIAA17超表达株和野生型种子4°C春化一星期，然后播种 于23°C光照培养室内保湿培养(每天16h光照，8h黑暗）14天，14天内每3天饶一次营养液(营 养液成份为：每升含5ml lMKN03,2ml lMCa(N〇3)2*4H20,2ml lMMgS〇4*7H20,2.5ml 20mM Fe.EDTA，2.5ml 1M磷酸缓冲液(pH5.5)，lml MS微量元素）；
[0037] B、取出-80°C储藏的Pst DC3000菌种划线到含有利福平50yg/mL的LB固体平板上， 28°C倒置培养两天后，接种单菌落于LB液体培养基中，28°C，250r/min培养两天后，转接于 新鲜的LB液体培养基中培养至对数生长期，然后低速离心收集菌体，再用10mm〇l/L MgCl2 重悬菌体，低速离心收集菌体再重悬一次后测定〇D6Q()，用Pst DC3000稀释细菌悬液的值为 OD6〇〇 = 0.002 左右。
[0038] C、选取28天的拟南芥苗(包括35SpBARN-AtIAA17超表达株和野生型），首先用取下 针头的注射器来吸取相应浓度的菌液，选取每株材料中较大的莲座叶，在植物叶片的背面 轻轻缓慢地进行注射而接种病原菌，然后用蒸馏水轻轻地清洗叶片表面，然后在接种3天后 取下叶片，取叶片时我们用打孔器将叶片剪成大小相同的小叶盘，每个样做20个重复，用研 棒将把这些小叶盘轻轻研碎，用手轻轻振荡悬液以使其充分均匀，利用梯度稀释的方法稀 释将不同浓度梯度(一般选取1〇 3、1〇4、1〇5、1〇6、1〇7五个浓度梯度进行稀释)的悬液涂到含有 相应抗性的LB(低盐)固体平板上，平板放入28°C培养箱中倒置培养2天，然后统计各个样品 在平板上的相应菌落数。
[0039] 如图3所示，通过比较35SpBARN-AtIAA17超表达株与野生型拟南芥的抗病性，发现 35SpBARN-AtIAA17超表达株在病原菌Pst DC3000侵染后叶片的细菌数目是野生型拟南芥 的20 %左右。
【主权项】
1. 一种拟南芥AtIAA17基因，其序列为SEQ ID No.l所示的核苷酸序列，或者是SEQ ID No. 1所示的核苷酸序列经核苷酸添加、删除、替换、修饰的保守性突变而获得的保守性变异 体。2. 包含权利要求1所述At IAA17基因的表达载体。3. 根据权利要求2所述的表达载体，其特征在于:它是pBARN质粒载体。4. 包含权利要求2或3所述表达载体的细胞。5. 根据权利要求4所述的细胞，其特征在于:它是大肠杆菌DH5a或根癌农杆菌GV3101。6. 权利要求1所述的AtIAA17基因在增强植物对病原菌Pst DC3000抗性中的应用。7. 根据权利要求6所述的应用，其特征在于:所述的植物为拟南芥。
【专利摘要】本发明公开了一种拟南芥抗病相关基因AtIAA17及制备方法和抗病应用，该基因是从拟南芥中分离获得，其序列为SEQ？ID？No.1所示核苷酸序列，制备方法为：在液氮中将植物幼嫩叶片样品研磨，利用Trirol提取试剂盒进行RNA的提取，提取的总RNA溶于双蒸水中，去除残留的DNA，获得的RNA为模板进行逆转录。通过该基因的过表达，可以人工创造抗性增强材料，通过构建该基因的超表达载体，转化拟南芥，获得有效的超表达转基因植株，为研究基因功能提供了一个有效的方法。
【IPC分类】C12R1/19, C12N1/21, C12N15/82, C12R1/01, C12N15/29, A01H5/00
【公开号】CN105524930
【申请号】CN201610110661
【发明人】施海涛, 方娇
【申请人】海南大学
【公开日】2016年4月27日
【申请日】2016年2月29日