包括本发明的多肽或检测器件。该检测试剂盒优选用于检测疟原虫引起的疾病(例如疟疾)。
[0042]本发明的检测器件或本发明的多肽是本发明的检测试剂盒的要件。本发明的检测试剂盒还可以包括:
1.配好的血清稀释液或血清稀释液组分溶液:血清稀释液，例如有北京赛驰生物科技有限公司的样本稀释液(产品编号070021-S2)、郑州博威嘉生物科技有限公司的加样变色样本稀释液(产品编号bwj010103)等。该血清稀释液用来稀释血清，试剂盒检测的血清要稀释适当倍数，例如2~200倍，优选10~100倍。
[0043]本发明的检测试剂盒还可以包括:
2.浓缩洗液:固体载体表面孵育血清及酶标二抗后，需用洗液清洗掉固体载体表面未结合的抗体和酶标二抗。浓缩洗液例如是1%的吐温20水溶液，使用时需稀释2~40倍、优选5~20倍。
[0044]本发明的检测试剂盒还可以包括:
3.酶标二抗溶液:疟原虫引起的疾病(例如疟疾)病人血清中的疟原虫自身抗体可与固体载体(例如SJ改性硅胶)上的本发明的多肽结合，二抗可与抗体结合，而二抗上的标记物可与发光底物反应，从而发出可检测的光。酶标二抗可以是例如辣根过氧化物酶标记的羊抗人IgG。作为酶标二抗溶液，可以列举出北京中杉金桥生物技术有限公司生产的辣根过氧化物酶标记的山羊抗人IgG(H+L)，产品编号ZB-2304。对酶标二抗在酶标二抗溶液中的浓度没有特殊限制，可以是例如lng~1000ng/mL。
[0045]本发明的检测试剂盒还可以包括:
4.发光液组分溶液:发光液可与酶标二抗上标记的辣根过氧化物酶反应，使得反应发出仪器可检测到的化学光。发光液由两种溶液混合而成，分别是A液一过氧化氢溶液，及B液一发光氨溶液。发光氨(鲁米诺)只有用氧化剂处理过才会发光。通常使用双氧水和一种氢氧化物碱的混合水溶液作为激发剂。在辣根过氧化物酶催化下，双氧水分解为氧气和水:
2 H2O2 一 O2 + 2 H2O 鲁米诺与氢氧化物反应时生成了一个双负离子，它可被过氧化氢分解出的氧气氧化，产物为一个有机过氧化物。该过氧化物很不稳定，立即分解出氮气，生成激发态的3-氨基邻苯二甲酸。激发态至基态转化中，释放的能量以光子的形式存在，波长位于可见光的蓝光部分。发光液组分溶液的例子例如Thermo Seientific公司的SuperSignal? ELISA FemtoMaximum Sensitivity Substrate,货号 37074。
[0046]本发明的检测试剂盒还可以包括:
5.一个或两个以上的反应腔体(例如中国专利授权公告CN202054829U)。
[0047]本发明的检测试剂盒还可以包括:
6.其他用于检测疟原虫引起的疾病(例如疟疾)的检测分子(例如多肽、蛋白质、核酸
) O
[0048]本发明的检测试剂盒还可以包括:
7.使用说明书。
实施例
[0049]以下，通过实施例对本发明进行更具体的说明，但并不是对本发明技术范围的限定。通过本说明书的记载，本领域技术人员可以容易的对本发明进行修饰/改变，这些包含在本发明的技术范围内。
[0050]1.30肽的制备与确认
实施例中使用的30肽具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，由上海吉尔生化有限公司合成，该多肽的表征可以通过氢谱和质谱确认合成了所述多肽。液相色谱法检测纯度:96.92%(面积归一法);质谱法检测(ES1-MS):计算分子量:3467.98，测试值3467.85。
[0051]2.检测器件的制备
检测芯片是以SJ改性硅胶(iPDMS薄膜)为固体支撑材料，在其上通过点样固定多肽溶液制备而成。改性硅胶是在传统的聚二甲基硅氧烷材料中加入带烯烃末端的、表面引发聚合反应的引发剂，并通过热交联(硅氢键键合)固定到聚二甲基硅氧烷的三维结构中，得到一种新的材料即SJ改性硅胶。其制作过程如图2所示。
[0052]其中的A和B为聚二甲基硅氧烷的两个组分，聚二甲基硅氧烷(Poly (dimethylsiloxane), Sylgard 184)购买自美国道康宁(DowCorning)公司，包含液态组分A (成分为金属钼催化剂与带乙烯基的二甲硅氧烷高分子前体混合物)和交联剂B (成分为带有乙烯基和S1-H基团的二甲基硅氧烷前体)两种成分。C为末端带乙烯基的引发剂，购于杭州东伟公司。最后修饰上的高分子是寡聚乙二醇甲基丙烯酸酯单体(Oligo (ethylene glycol) methacrylate,以下简称 0EGMA,分子量 Mw = 526)购买于Aldrich。将聚二甲基硅氧烷前体A和交联剂B与带乙烯基末端的引发剂C以A:B:C=10:1:0.5比例充分混合。通过固化反应制成透明的弹性硅橡胶，然后通过SIP技术进行表面修饰即可得到SJ改性硅胶。实验表明，SJ改性硅胶的表面有足够高密度的、通过共价键固定的引发剂，其可以通过表面引发聚合反应(SIP)实现表面高分子修饰。使用poly(OEGMA)(聚乙二醇甲基丙烯酸酯)进行反应获得聚乙二醇(Polyethylene Glycol,PEG)修饰的表面，实现较强的抗蛋白非特异性吸附的能力。
[0053]制好的SJ改性硅胶薄膜需保存在4°C冰箱中。
[0054]采用晶芯?PersonalArrayerTM 16个人点样仪在改性娃胶上制备多肽微阵列,过程为:
I)预处理
将SJ改性硅胶薄片(15 X 15_2)浸泡在活化液中，30min后取出用去离子水淋洗3次，用氮气吹干，马上用于点样。
[0055]2)点样
将点样液稀释好并转移到384孔板相应的微孔中，将带样本的384孔板置于点样仪基台上，同时将预处理的改性硅胶薄片置于点样仪的基台上，马上进行点样。点样环境条件为室温(25°C)，湿度设定为50%。制成的多肽微阵列上每个点的点样量约为0.6nL，样点半径为200 μ m。
[0056]3)化学固定
刚制好的多肽微阵列要放在恒温恒湿箱(26°C，60%湿度)中固定至少6h。化学固定过程如图3所7JK。
[0057]首先通过点样仪将包含有捕获多肽分子的缓冲液点在改性硅胶薄膜上，接着缓冲液开始蒸发，捕获多肽分子与SJ改性硅胶表面亲密接触并相互作用，通过化学结合，改性硅胶表面的ploy (OEGMA)高分子的末端-COOH与多肽分子的一NH2形成稳定共价键，进而将有化学活性的多肽分子固定在SJ改性硅胶表面。
[0058]5)装配
固定6h的多肽微阵列必须在两天内装配好。首先通过背胶将SJ改性硅胶薄片贴在专门的反应柱上，盖上反应腔体。一个反应器由两个反应柱和一个反应腔体组成。
[0059]6)保存
装配好的多肽微阵列，需要抽真空密封，保存在4°C的冰箱中，备用。
[0060]3.用检测器件进行检测检验步骤
1、开始检测前，将浓缩清洗液按1:10的比例加入纯化水或蒸馏水进行稀释，稀释完成后直接使用。使用移液枪将2mL清洗液加到芯片表面，浸泡芯片3分钟，保证芯片表面被完全浸润。
[0061]2、将待测血清样本用样本稀释液按照1:40稀释混匀。
[0062]3、弃去浸泡芯片的清洗液，在芯片表面完全湿润的状态下，每个血清样本吸取200 μ L稀释后的血清加入到芯片反应器内。
[0063]4、将芯片反应器放入芯片固定座，放到摇床上，开启摇床，频率150转/分钟，室温孵育30分钟。
[0064]5、弃去芯片反应器内的血清样本，用15mL洗液清洗反应腔体和芯片表面3次。
[0065]6、清洗完成后，每个芯片反应器分别加入200 μ L酶标抗体溶液，将芯片反应器放入芯片固定座，放到摇床上，开启摇床，频率150转/分钟，室温孵育30分钟。
[0066]7、弃去芯片反应器内的酶标抗体溶液，用15mL洗液清洗反应腔体和芯片表面3次。
[0067]8、清洗完成后，取下反应腔体，每个芯片表面分别加入15 μ L发光底物液，使发光液能均匀的铺于芯片表面。
[0068]9、将加入了发光液的芯片置于凝胶成像仪中化学发光成像，并判读结果。
[0069]恶性疟引起的疟疾病人的血清及其他疾病病人血清样本由合作医院提供。血清由相关人员用冰块/干冰等包裹运送或快递至实验室。
[0070]阴性对照有PBS缓冲液(即在第3步中不用待测血清孵育,而用PBS溶液孵育,其余步骤相同)的对照，血清稀释液的对照，及阴性病人(指健康人及非疟疾病人)血清的对照。
[0071]多肽微阵列的点样模式如图4所示。其中，三角形的17个点的样本为人IgG，作为实验的定位点；星形点的样本多肽即为本发明的多肽SEQ ID NO:1，它是疟疾自身抗原蛋白多肽，会对疟疾患者血清产生响应；圆形点的的样本是其他的疟疾自身抗原蛋白多肽，作为实验的检测指标(这些多肽有响应说明检测血清中有疟疾自身抗体)。
[0072]实验结果如图5~6所示。其中，图5显示了阴性对照的检测结果，只有三角形所示的点的样本有响应。图6显示了疟疾病人血清的检测结果，三角形、星形点和圆形的样本有响应。需要说明的是，仪器测得信号值由低到高，相应的信号点颜色由黑一白渐变。
【主权项】
1.一种多肽，其氨基酸序列如SEQ ID N0:1所示，即:AGKKIDKKKEQANKKNNNNKNKNKNKNLSK。2.—种检测器件，其包括: 固体载体，以及 连接于该固体载体上的权利要求1所述的多肽。3.根据权利要求2所述的检测器件，其中，所述固体载体是SJ改性硅胶。4.一种检测试剂盒，其包括权利要求1所述的多肽、或者权利要求2或3所述的检测器件。5.抗权利要求1所述的多肽的抗体。6.权利要求1所述的多肽在制备用于检测疟原虫引起的疾病的试剂盒或检测器件中的用途。7.权利要求6所述的用途，其中，所述疾病是疟疾。8.权利要求6或7所述的用途，其中，所述疟原虫是恶性疟。9.编码权利要求1所述的多肽的核酸、包含所述核酸的表达载体、导入了所述表达载体的宿主细胞。
【专利摘要】本发明涉及多肽、包含该多肽的检测器件和检测试剂盒。本发明的多肽由SEQIDNO：1所示的氨基酸序列构成。本发明的多肽、包含该多肽的检测器件和检测试剂盒在疟疾的诊断中是有用的。
【IPC分类】C07K14/445, C12N15/63, C07K16/20, G01N33/68, C12N15/30
【公开号】CN105566477
【申请号】CN201410627764
【发明人】马宏伟, 马青
【申请人】中国科学院苏州纳米技术与纳米仿生研究所
【公开日】2016年5月11日
【申请日】2014年11月10日