多肽、包含该多肽的检测器件和包含该器件的检测试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物检测领域，特别是可用于肠道病毒71型抗体IgG的临床辅助诊断 的多肽、包含该多肽的检测器件的检测试剂盒。
【背景技术】
[0002] 肠道病毒71型（Human enterovirus 71)，简称EV71，是引起婴幼儿手足口病 (hand-foot and mouth disease ;HFMD)主要病原体之一。人类肠病毒71型于1969年首 次从加利福尼亚患有中枢神经系统疾病的婴儿粪便标本中分离出来的。
[0003] EV71主要引起手足口病，还可引起无菌性脑膜炎、脑干脑炎和脊髓灰质炎样的麻 痹等多种神经系统疾病。手足口病和中枢神经系统感染是EV71感染而引起的两大常见临 床症状。病毒从咽部或肠道侵入，在局部黏膜或淋巴组织中繁殖，并由局部排出，此时可引 起局部症状。继而病毒又侵入局部淋巴结，并由此进入血液循环导致第一次病毒血症。病毒 经血循环侵入网状内皮组织、深层淋巴结、肝、脾、骨髓等处大量繁殖并由此进入血液循环， 引起第二次病毒血症。病毒可随血流进入全身各器官，如中枢神经系统、皮肤黏膜、心脏等 处，进一步繁殖并引起病变。易感者感染EV71后，出现血管变态反应和组织炎症病变。当 病毒累及中枢神经系统时，组织炎症较神经毒性作用更加强烈，中枢神经系统小血管内皮 最易受到损害。细胞融合、血管炎性变、血栓形成可导致缺血和梗死。在脊髓索、脑干、间 脑、大脑和小脑的局部组织中，除嗜神经性作用外，还存在广泛的血管周围和实质细胞炎症 道病毒71型危害极大，目前急需简便快捷准确的仪器是实现对其的快速检测。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于提供一种多肽、包含该多肽的检测器件、以及包含该检测器件 的检测试剂盒，它们对肠道病毒71型抗体IgG的临床辅助诊断有用的。本发明目的在于提 供该多肽在制备可用于肠道病毒71型诊断的检测试剂盒中的用途。
[0005] 即，本发明包含下述技术方案：
[0006] 1. 一种多肽，其氨基酸序列如 SEQ ID NO :1 所示，即：LGDAFGTGFTDAVSREVEAL。
[0007] 2. -种检测器件，其包括：
[0008] 固体载体，以及
[0009] 连接于该固体载体上的权利要求1所述的多肽。
[0010] 3.根据权利要求2所述的检测器件，其中，所述固体载体是SJ改性硅胶。
[0011] 4.根据权利要求2所述的检测器件，其用于肠道病毒71型抗体IgG的临床辅助诊 断。
[0012] 5. -种检测试剂盒，其包括权利要求2~4中任一项所述的检测器件。
[0013] 6.根据权利要求5所述的检测试剂盒，其用于肠道病毒71型抗体IgG的临床辅助 诊断。
[0014] 7.权利要求1所述的多肽在制备检测试剂盒中的用途。
[0015] 8.根据权利要求7所述的用途，其中，所述检测试剂盒用于肠道病毒71型抗体 IgG的临床辅助诊断。
[0016] 9.根据权利要求7所述的用途，其中，所述检测试剂盒包括权利要求2~4中任一 项所述的检测器件。
[0017] 将本发明应用于肠道病毒71型抗体IgG的临床辅助诊断，能够取得令人满意的效 果。
【附图说明】
[0018] 图1对SJ改性硅胶（iPDMS薄膜）的制作过程进行说明的示意图。
[0019] 图2说明多肽微阵列点样模式的示意图。
[0020] 图3是显示对健康正常人或非肠道病毒71型感染病人血清进行检测的结果的照 片。
[0021] 图4是显示对肠道病毒71型感染病人血清进行检测的结果的照片。
[0022] 发明的【具体实施方式】
[0023] 本发明的多肽
[0024] 在另一个方面中，本发明提供对对肠道病毒71型抗体IgG的临床辅助诊断有用的 多肽，由SEQ ID ΝΟ:1所示的氨基酸序列构成，即：LGDAFGTGFTDAVSREVEAL。如实施例所示， 本发明的多肽对肠道病毒71型感染病人的血清呈阳性反应，而对健康正常人或非肠道病 毒71型感染病人血清呈阴性反应。因此，本发明的多肽作为肠道病毒71型抗体IgG的临 床辅助诊断工具是有用的。本发明的多肽可以用于制造可用于肠道病毒71型抗体IgG的 临床辅助诊断的检测器件（例如下述的本发明的检测器件）或检测试剂盒（例如下述的本 发明的检测试剂盒）。
[0025] 本发明的多肽可以适宜采用（1)化学合成方法、或（2)酶反应合成方法等公知方 法来获得，但不限于此，其中化学合成更为简便。在化学合成本发明的多肽情况下，通过使 用肽合成仪合成或者半合成该多肽来进行。作为化学合成方法，可以列举出例如肽固相合 成法等。这样合成的肽可以采用常规手段例如离子交换色谱、反相高效液体色谱、亲和色谱 等进行纯化。这样的肽固相合成方法以及其后的肽纯化都是本技术领域公知的。
[0026] 此外，在通过酶反应生产本发明的多肽的情况下，可以采用例如国际公开小册子 W02004/011653号所述的方法。即，可以这样来生产：将一方的氨基酸或二肽的羧基末端被 酯化或酰胺化而得到的氨基酸或二肽、与氨基酸处于游离状态的氨基酸（例如羧基保护的 氨基酸）在肽合成酶的存在下进行反应，生成的二肽或三肽。作为肽合成酶，可以列举出： 具有生成肽的能力的微生物的培养物、由该培养物分离的微生物菌体、或该微生物的菌体 处理物、或该微生物来源的肽合成酶。
[0027] 而且，除了上述的酶方法、化学合成方法以外，还可以采用例如基因工程方法来生 产本发明的多肽。
[0028] 本发明的多肽的氨基酸序列可以采用常规的方法进行分析和确认，例如可以利用 质谱、色谱等方法来进行分析和确认。
[0029] 本发明的检测器件
[0030] 在另一方面中，本发明还提供一种检测器件（本发明的检测器件），其包括固体载 体、以及连接于该固体载体上的本发明的蛋白质或本发明的多肽。所述检测器件对于肠道 病毒71型抗体IgG的临床辅助诊断是有用的。
[0031] 在本发明中，对固体载体没有特殊限制，只要是作为固体或不溶性材料（例如是 可以通过过滤、沉淀、磁性分离等从反应混合物中分离的材料）的载体即可。
[0032] 构成固体载体的材料包括但不限于：硅胶（聚二甲基硅氧烷，PDMS)、纤维素、特氟 隆?、硝基纤维素、琼脂糖、葡聚糖、壳聚糖、聚苯乙烯、聚丙烯酰胺、聚酯、聚碳酸酯、聚酰胺、 聚丙烯、尼龙、聚偏二氟乙烯、胶乳、二氧化硅、玻璃、玻璃纤维、金、铂、银、铜、铁、不锈钢、铁 氧体、硅晶片、聚乙烯、聚乙烯亚胺、聚乳酸、树脂、多糖类、蛋白（白蛋白等）、碳或它们的组 合等。
[0033] 固体载体的形状包括但不要限于：珠子、磁珠、薄膜、微细管、滤膜、板、微量板、碳 纳米管、传感器芯片等。正如本技术领域公知的那样，薄膜或板等平坦的固体载体上可以设 置凹坑、沟槽、滤膜底部等。
[0034] 在本发明中，磁珠可以具有约25nm~约Imm范围的球体直径。在优选的实施方式 中，磁珠具有约50nm~约10 μ m范围的直径。磁珠的尺寸可以根据特定的用途来进行选择。
[0035] 在本发明中，由Sepharose等高交联球形琼脂糖制成的珠子具有约24 μm~约 165 μ m范围的直径。优选地，高交联球形琼脂糖珠具有约24 μ m~约44 μ m范围的直径。 高交联球形琼脂糖珠的尺寸可以根据特定的用途来进行选择。
[0036] 具有疏水性表面的固体载体的例子包括可从Polysciences，Warrington，PA或 Spherotech，Liberville，IL购买的制品等聚苯乙稀胶乳珠。
[0037] 二氧化硅（SiO2)-处理或二氧化硅（SiO2)基的固体载体的例子包括可从 Polysciences，Warrington，PA购买的超常磁性二氧化娃珠等，其可以用于捕捉核酸（例如 DNA)。或者，还可以使用可从Dynal Biotech购买的M-280等。