的片段经突变片段组装后转化到DMT感受态细胞，转化产物涂布于含100mg/L氨苄青霉素的 LB平板，经37°C过夜培养，从平板上挑10个单菌落进行菌落PCR验证，从验证成功的菌落中 挑3个单菌落接入LB液体培养基，10h后将每个菌液保存到两个甘油管中，一份-20°C保藏， 一份用于测序。将测序正确的突变体从甘油管接种到LB液体培养基中过夜培养，过夜后先 保存甘油管，然后将剩余菌液抽提质粒并转化接入BL21(DE3)感受态细胞。
[0024] (2)突变体酶的表达与纯化
[0025]突变体表达及纯化过程如实施例1所述。
[0026]实施例3CotA漆酶突变体酶活分析。
[0027] (1)酶活单位定义
[0028]采用ABTS方法测定漆酶酶活时，定义每分钟转化Ιμπιο?底物时所需要的酶量作为 一个活力单位。
[0029] (2)酶活力测定步骤
[0030]预热：取2.4mL ρΗ4.0的柠檬酸缓冲液于试管中，在试管中加入0.5mL ABTS溶液 (ABTS的终浓度为0.5mM)置于37°C水浴锅中预热2min。
[0031 ]反应:加入0 · lmL样品酶液，震荡均匀。
[0032]测量:将震荡均匀的样品用分光光度计进行动力学测量，在420nm波长下测量30s 内每秒钟0D值的变化量(反应速率为匀速反应)并计算酶活力。
[0033]实施例4漆酶动力学参数测定
[0034]以不同浓度的ABTS作为底物来测定纯酶的动力学参数。在3mL的反应体系中ABTS 的终浓度范围是5-50(^。311^的反应体系包括2mL柠檬酸缓冲液(0.1M;pH4.0)、0.1mIiiMi 液、0.9mL的ABTS溶液(根据终浓度取相应体积的ABTS母液后用去离子水稀释至0.9mL)。将 反应体系置于37 °C水浴锅中反应片刻，在420nm波长下测定30s内每秒钟0D值的变化量(反 应速率为匀速反应）。根据酶活力公式计算酶活。以1-·^作图，得出一直线。直线的斜率 ￥ 1^1 为^^，与纵轴的交点（〇，7)，与横轴的交点〇>。这样可以求出动力学参数 VmajPKm，测出蛋白含量后就能求出kcat。
[0035] 酶活力公式：酶活力
[0036] 式中：Δ 0D-吸光度0D的变化值V总-反应体系的体积
[0037] η-酶液稀释倍数 At-反应时间
[0038] Vo-酶液的体积 ε_底物的摩尔吸光系数
[0039]实施例5漆酶突变体的底物专一性
[0040] 以ABTS为底物测定了野生型和突变体漆酶的动力学参数Vmax、Km、kcat、k cat/Km。
[0041 ] 表1野生型(WT)和突变体漆酶的动力学参数
[0042]
[0043] Km值可以判断酶的专一性和天然底物，最适底物时酶的亲和力最大1最小。
[0044]在一定酶浓度，酶对特定底物的Vmax也是一个常数。
[0045] krat表示当酶被底物饱和时每秒钟每个酶分子转换底物的分子数，这个常数通称 为催化常数，其值越大表示酶的催化效率越高。
[0046] krat/Km是酶和底物反应形成的表观二级速率常数，有时也称为专一性常数。
[0047]从表1可以计算得出，突变体与野生型漆酶相比，G417L的专一性和催化效率有所 提高。突变体G417L的专一性是野生型的1.9倍，催化效率是野生型的1.5倍。
[0048]虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技 术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范 围应该以权利要求书所界定的为准。
【主权项】
1. 一种短小芽胞杆菌CotA漆酶的突变体，其特征在于，是以野生型短小芽胞杆菌CotA 漆酶基因为模板将其第417位的Gly突变为Leu。2. 权利要求1所述的突变体的制备方法，包括如下步骤： (1) 以前期构建的质粒pCo 1 dII-CotA为模板，采用滚环PCR的方法，设计引物时在重叠 区域引入突变位点，利用PCR扩增质粒pColdll-CotA得到含有编码CotA漆酶突变体的基因 序列的开环重组载体； (2) 在PCR产物中加 DMT酶消化PCR产物，然后进行1 %琼脂糖凝胶电泳回收片段； (3) 利用特殊的重组酶和同源重组原理，将开环重组载体无缝拼接，形成环状结构； (4) 将环状质粒转化到DMT感受态细胞中，平板培养挑取单菌落测序，为的是提取到正 确突变质粒； (5) 将正确的重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)，诱导表达。3. 根据权利2所述的方法，其特征在于，还进一步包括使用AVANT蛋白纯化仪和 HisTrapHP lmL镍柱、脱盐柱、阴离子交换柱对漆酶进行纯化。4. 根据权利2所述的方法，其特征在于，将步骤(5)获得的重组菌在含有氨苄青霉素的 LB培养基中37°C液体培养过夜，后接入含有氨苄青霉素的LB发酵液体培养基37°C培养至 0D6Q() ? 0.5，迅速降温至15°C静置至少30min，加入最终浓度0.2mM的诱导剂IPTG诱导，26h时 离心获得沉淀，用缓冲液重悬，即为粗酶液。突变体G417L对底物2，2-联氮-二(3-乙基-苯并 噻唑-6-磺酸)二铵盐( ABTS)具有更高的专一性，是野生型的倍，且催化效率是野生型的 1.5倍。
【专利摘要】本发明公开了一种底物特异性提高的短小芽胞杆菌CotA漆酶突变体及其制备方法，属于基因工程和酶工程领域。本发明以本实验室前期构建的pColdII-CotA重组质粒为模板，将野生型CotA漆酶氨基酸序列的第417位Gly突变为Leu，随后以野生型CotA漆酶为对照，发现突变体G417L对底物2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐(ABTS)具有更高的专一性，提升了短小芽胞杆菌CotA漆酶的工业应用前景。
【IPC分类】C12N15/70, C12N9/02, C12N15/53
【公开号】CN105602912
【申请号】CN201510718557
【发明人】管政兵, 陈宇, 廖祥儒, 蔡宇杰, 赵宏
【申请人】江南大学
【公开日】2016年5月25日
【申请日】2015年10月29日