达载体和轻链表达载体共转染293T细胞，得到重组细胞。
[0071]三、抗体的制备
[0072] 1、取步骤二得到的重组细胞，在含2%胎牛血清的DMEM培养基培养72h，然后4°C、 4000rpm离心30min，收集上清液。
[0073] 2、亲和层析
[0074]亲和层析的层析柱规格:长度3cm，内径lcm;
[0075] 亲和层析的柱填料:protein A beads(Thermo,产品目录号10006D);
[0076] 操作步骤:①将300mL步骤（1)得到的上清液上样于亲和层析柱，4°C孵育16小时； ②用60ml结合缓冲液洗涤柱子;③用30mL洗脱缓冲液洗脱目的蛋白，收集过柱后溶液。 [0077]结合缓冲液:取甘氨酸112.6g、氯化钠175.2g，溶于水并用水定容至1L，用氢氧化 钠调pH至8.0。
[0078] 洗脱缓冲液:取甘氨酸7.5g，溶于水并用水定容至500ml，用盐酸调pH至3.0。
[0079] 3、取步骤2得到的过柱后溶液，用超滤浓缩管浓缩并将体系置换为PBS缓冲液 (pH7.2、10mM)，得到lml蛋白浓度为2mg/ml的抗体溶液。
[0080] 实施例3、抗体的效果
[0081 ] 一、EB0V假病毒的制备
[0082] 1、将人工合成的序列表的序列8所示的双链DNA分子插入质粒pcDNA3.1( + )的 BamHI和No?酶切位点之间，得到重组质粒pcDNA3 . l-GPAmuc。序列表的序列8所示的双链 DNA分子编码序列表的序列7所示的蛋白质(EB0V的GPAmuc蛋白）。
[0083] 2、将重组质粒 pcDNA3.1-GPAmuc 和质粒 pNL4-3R-E-luciferase 共转染 293T 细胞， 得到重组细胞。
[0084] 质粒pNL4-3R-E_luciferase中含有HIV-1病毒基因组的全部基因（与野生HIV-1病 毒基因组的差异仅在于envelope基因发生了移码）。重组质粒pcDNA3 . l-GPAmuc和质粒 pNL4-3R-E-luciferase共转染宿主细胞，可以表达EB0V假病毒。EB0V假病毒只有病毒颗粒 表面的膜蛋白是GPAmuc蛋白，其他均为HIV-1病毒的成分，只能在被感染的细胞中复制基 因组并表达荧光素酶报告基因，不能再产生有感染性的病毒颗粒。GPAmuc蛋白与EB0V的GP 蛋白相比，差异仅在于缺失了一段mucin-1 ike domain区域，缺失此区域能明显提高假病毒 进入易感细胞的能力。
[0085] 3、将步骤2得到的重组细胞，在含10%胎牛血清的DMEM培养基培养60h。
[0086] 4、完成步骤3后，取培养上清，即为EB0V假病毒的病毒液(简称EB0V病毒液）。
[0087] 5、利用p24定量检测的ELISA试剂盒检测EB0V病毒液中的病毒滴度。
[0088]二、单克隆抗体的中和活性检测
[0089] 1、取实施例2制备的抗体溶液，用PBS缓冲液(pH7.2、10mM)进行倍比稀释，得到抗 体稀释液。
[0090] 2、取96孔细胞培养板，每孔加入100微升抗体稀释液和50微升EB0V病毒液，使得混 合体系中的抗体浓度为 50μg/ml、16 · 67μg/ml、5 · 56μg/ml、1 · 85μg/ml、0 · 62μg/ml、0 · 21yg/ ml、0.07μg/ml或0.02μg/ml (以蛋白浓度计），37°C静置孵育1小时。用等体积PBS缓冲液 (pH7.2、10mM)代替抗体稀释液，作为病毒对照。用等体积含10 %胎牛血清的DMEM培养基代 替EB0V病毒液，作为细胞对照。
[0091] 3、完成步骤2后，取所述细胞培养板，每孔接种100微升VeroE6细胞悬液(用于制备 细胞悬液的溶剂为含1〇%胎牛血清的〇1^1培养基，细胞悬液中的￥從成6细胞浓度为2乂105 个细胞/ml)，37°C静置孵育64小时。
[0092] 4、完成步骤3后，取所述细胞培养板，吸弃上清，每孔加入150微升裂解液(微格拉 斯生物技术，货号T003，按说明书操作），37°C静置孵育5分钟。
[0093] 5、完成步骤4后，取所述细胞培养板，检测荧光素酶活性。
[0094]荧光强度结果见表1(每个处理设置三个复孔，表1的第二列、第三列和第四列分别 列出了三个复孔各自的值）。
[0095]表1荧光强度的结果
[0096]
[0097]中和活性（％ ) = [1-(试验组的荧光强度-细胞对照的荧光强度)/(病毒对照的荧 光强度-细胞对照的荧光强度）]X 100%。
[0098]中和活性的结果见图1。
[0099]利用Prism 5软件计算中和活性为50 %时的抗体浓度，即抗体的IC5Q值，抗体的 IC5〇 值为 0.78μg/ml。
[0100] 实施例4、抗体的特异性
[0101] 一、VSV假病毒的制备(VSV即疱疹性口炎病毒）
[0102] 1、将人工合成的序列表的序列9所示的双链DNA分子插入质粒pcDNA3.1( + )的 BamHI和NotI酶切位点之间，得到重组质粒。序列表的序列9所示的双链DNA分子编码VSV的 壳G糖蛋白。
[0103] 2、将步骤1得到的重组质粒和质粒pNL4-3R-E-luciferase共转染293T细胞，得到 重组细胞。
[0104] 3、将步骤2得到的重组细胞，在含10%胎牛血清的DMEM培养基培养60h。
[0105] 4、完成步骤3后，取培养上清，即为VSV假病毒的病毒液(简称VSV病毒液）。
[0106] 5、利用p24定量检测的ELISA试剂盒检测VSV病毒液中的病毒滴度。
[0107]二、HIV假病毒的制备
[0108] 1、将人工合成的序列表的序列10所示的双链DNA分子插入质粒pcDNA3.1( + )的 BamHI和Notl酶切位点之间，得到重组质粒。序列表的序列10所示的双链DNA分子编码HIV-1CNE30的GP蛋白。
[0109] 2、将步骤1得到的重组质粒和质粒pNL4-3R-E-luciferase共转染293T细胞，得到 重组细胞。
[0110] 3、将步骤2得到的重组细胞，在含10%胎牛血清的DMEM培养基培养60h。
[0111 ] 4、完成步骤3后，取培养上清，即为HIV假病毒的病毒液(简称HIV病毒液）。
[0112] 5、利用p24定量检测的ELISA试剂盒检测HIV病毒液中的病毒滴度。
[0113] 三、SUDV假病毒的制备(SUDV即埃博拉病毒苏丹亚型）
[0114] 1、将人工合成的序列表的序列11所示的双链DNA分子插入质粒pcDNA3.1( + )的 BamHI和Notl酶切位点之间，得到重组质粒。序列表的序列11所示的双链DNA分子编码SUDV 的GPAmuc蛋白。
[0115] 2、将步骤1得到的重组质粒和质粒pNL4-3R-E-luciferase共转染293T细胞，得到 重组细胞。
[0116] 3、将步骤2得到的重组细胞，在含10%胎牛血清的DMEM培养基培养60h。
[0117] 4、完成步骤3后，取培养上清，即为SUDV假病毒的病毒液(简称SUDV病毒液）。
[0118] 5、利用p24定量检测的ELISA试剂盒检测SUDV病毒液中的病毒滴度。
[0119] 四、单克隆抗体的中和活性检测
[0120] 用VSV病毒液、HIV病毒液或SUDV病毒液代替EB0V病毒液，其它同实施例3的步骤 --〇
[0121 ]抗体对VSV病毒的中和活性的结果见图2。
[0122]抗体对HI V病毒的中和活性的结果见图3。
[0123] 抗体对SUDV病毒的中和活性的结果见图4。
[0124] 结果表明，实施例二制备的抗体溶液对VSV病毒、HI V病毒和SUDV病毒的中和活性 均为20%以下，为阴性结果。
【主权项】
1. 一种IgG抗体，由轻链和重链组成；所述重链中的重链可变区中的⑶R1、CDR2和⑶R3 依次为序列表的序列3自N末端第45-52位氨基酸残基、第70-77位氨基酸残基和第116-135 位氨基酸残基;所述轻链中的轻链可变区中的CDR1、CDR2和CDR3依次为序列表的序列5自N 末端第45-52位氨基酸残基、第70-72位氨基酸残基和第109-121位氨基酸残基。2. 如权利要求1所述的IgG抗体，其特征在于： 所述重链为如下(a)或(b): (a)序列表的序列3自N末端第20-474位氨基酸残基组成的 蛋白质；（b)序列表的序列3所不的蛋白质； 所述轻链为如下（c)或(d):(c)序列表的序列5自N末端第20-234位氨基酸残基组成的 蛋白质；（d)序列表的序列5所不的蛋白质。3. 编码权利要求2所述IgG抗体的基因，其特征在于： 编码所述重链的基因为如下（1)或(2)或(3): (1) 序列表的序列4自5 '末端第889-2313位核苷酸所不的DNA分子； (2) 序列表的序列4自5'末端第946-2313位核苷酸所不的DNA分子； (3) 序列表的序列4所示的DNA分子； 编码所述轻链的基因为如下(4)或(5)或(6): (4) 序列表的序列6自5 '末端第889-1593位核苷酸所不的DNA分子； (5) 序列表的序列6自5 '末端第946-1593位核苷酸所不的DNA分子； (6) 序列表的序列6所不的DNA分子。4. 权利要求1或2所述IgG抗体在制备用于抑制埃博拉病毒扎伊尔亚型的药物中的应 用。5. -种用于抑制埃博拉病毒扎伊尔亚型的药物，其活性成分为权利要求1或2所述IgG 抗体。6. 权利要求1或2所述IgG抗体在制备用于中和埃博拉病毒扎伊尔亚型的药物中的应 用。7. -种用于中和埃博拉病毒扎伊尔亚型的药物，其活性成分为权利要求1或2所述IgG 抗体。8. 权利要求1或2所述IgG抗体在制备用于预防和/或治疗埃博拉病毒扎伊尔亚型引起 的埃博拉出血热的药物中的应用。9. 一种用于预防和/或治疗埃博拉病毒扎伊尔亚型引起的埃博拉出血热的药物，其活 性成分为权利要求1或2所述IgG抗体。
【专利摘要】本发明公开了一种单克隆抗体Q314及应用。本发明保护的单克隆抗体Q314，为一种IgG抗体，由轻链和重链组成；所述重链中的重链可变区中的CDR1、CDR2和CDR3依次为序列表的序列3自N末端第45-52位氨基酸残基、第70-77位氨基酸残基和第116-135位氨基酸残基；所述轻链中的轻链可变区中的CDR1、CDR2和CDR3依次为序列表的序列5自N末端第45-52位氨基酸残基、第70-72位氨基酸残基和第109-121位氨基酸残基。本发明对于埃博拉病毒扎伊尔亚型的防控具有重大的应用价值。
【IPC分类】C07K16/10, C12N15/13, A61K39/42, A61P31/14
【公开号】CN105622750
【申请号】CN201610070023
【发明人】张林琦, 张绮, 史宣玲, 王若珂, 左亚男
【申请人】清华大学
【公开日】2016年6月1日
【申请日】2016年2月1日