物技术有限公司提供），2.0μ1上、下引物，4μ1 ddH20，1.5μ1基因组DNA，PCR扩增程序为:94°C预变性3min，94 °C变性45s，55 °C (部分引物56 °C)退火45s，72°C复性lmin，35个循环，72°C延伸7min，最后4°C保存，扩增产物用8%非变性 聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，以150V为恒定电压，电泳90分钟，银染染色，最后获得16对具有 多态性的 SSR 分子标记（HD24*，HD25，HD26*，HD34*，HD35*，HD37，HD39，HD43*，HD55*，HD62*， HD63*，HD64，HD74，HD80，HD83*，HD88*)，它们的序列信息见表 1;
[0020] 4、16对羊踯躅多态性SSR分子标记的评估:将筛选获得16对多态性SSR标记在安徽 金寨和浙江磐安两个羊踯躅自然居群(每个居群含21个个体）中进行PCR扩增与电泳检测， 参照20bp DNA ladder，根据分子量大小对扩增结果读带，记录碱基数，无条带记为"0"，得 到SSR表型数据，利用Genalex 6.1软件各SSR位点在不同自然居群中的等位基因数，观测杂 合度、期望杂合度以及是否符
[0021 ] Hardy-Weinberg定律等遗传参数(见表1)，结果发现每对SSR标记的等位基因数为 4-16个，杂合度（He)范围为0.489-0.908,其中HD24，HD26，HD34，HD35，HD43，HD55，HD62， HD63，HD83和HD88偏离Hardy-Weinberg定律，其余的7对SSR标记至少是在一个自然居群中 不偏离Hardy-Weinberg定律，表明这些SSR分子标记可以用于羊掷躅的遗传多样分析和羊 踯躅的保护与利用研究；
[0022] 5、多态性SSR分子标记的应用：为了研究羊踯躅的遗传多样性、有效地保护该物 种，从16多态性SSR分子标记中选取扩增效果最好，条带最清晰的12对SSR分子标记(见表2) 在8个羊踯躅自然居群(含193个个体)遗传多样性和遗传结构的评估分析(参照图1所示）， 开展羊踯躅的保护遗传学的研究与应用，PCR扩增、扩增产物的检测及 SSR条带统计的方法 同上述步骤，统带结束后，利用Genalex 6.1软件计算遗传多样性指数，遗传距离(D)和遗传 一致度（I);利用P0PGENE计算Nei ' s多样性指数(H)，遗传分化系数(Fst)，基因流(Nm)等。在 此基础上利用Genalex 6.1软件进行主成分分析(Principal coordinate analysis，PCA)， 并分析羊踯躅居群间，居群内的遗传分化水平等，另外，采用PowerMarker V3 · 25软件对各 位点进行分析，得多态信息量(PIC)指数，并进行非加权算术平均聚类(Unweighted pair-group method with arithmetic mean, UPGMA)，结果发现羊掷躅 Shannon 多样性指数 （I) 为 1.768,基因多样性指数(Η)为0.777,江西省金溪县居群的遗传变异最丰富，而福建政和的 遗传多样性水平最低(见表2); PCA分析和UPGMA分析都表明8个自然群体被分为两组，江西 永修居群独立为一组(图2)，建议羊踯躅最好以就地保护为主，应优先保护金溪、永修居群， 同时增加对政和和京山居群的保护权重。
[0023] 表1羊踯躅16对多态性引物序列特征及其在个自然居群中的遗传特性
[0024]
[0<
[0026] *表示显著偏离哈德温伯定律(p〈0.05) ;F:正向引物;R:反向引物;A:等位基因数； H。:观测杂合度;He :期望杂合度.
[0027] 表2羊踯躅8个自然居群的遗传多样性
[0028]
[0029]以上所述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范 围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方 案作出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
【主权项】
1.一种濒危羊踯躅多态性SSR分子标记开发与应用的方法，其特征在于，（1)羊踯躅SSR 分子标记的获得:利用简化基因组测序技术对濒危羊踯躅(Rhododendron molle G·Don)基 因组进行测序，经序列数据过滤、聚类和组装等步骤，得到171.534Mb的基因组序列，包含 498,252〇 〇1^丨88，测序质量合格，6(：分布正常，采用33财叟索软件对(3〇1^丨8序列进行331?检测 搜索，最后从11，961微卫星位点中开发得到11，687SSR分子标记； (2) SSR分子标记的筛选与合成:从11，687SSR分子标记中选取94对SSR进行遗传多样性 的筛选鉴定，SSR分子标记初选的条件是2个碱基重复单元的SSR需要有10~15个拷贝的重 复，3个碱基重复单元的SSR需要有6~12个拷贝的重复，开发设计好的SSR分子标记引物序 列合成； (3) 羊踯躅多态性SSR的鉴定:采用不同地理分布的羊踯躅DNA对合成94对SSR引物进行 PCR扩增及聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，最后从94对SSR引物中获得16对的多态性SSR分子标 记，见表1; (4) 羊踯躅多态性SSR分子标记的有效性评估:将筛选获得16对多态性SSR标记在2个羊 踯躅自然居群，每个居群含21个个体，进行PCR扩增，评估分析了这16对多态性SSR标记能够 用于羊踯躅的遗传多样性分析和保护生物学研究，见表1; (5) 多态性SSR分子标记应用:运用本研究获得的多态性SSR分子标记在8个羊踯躅自然 居群，含193个个体，进行了遗传多样性分析，获得了一些保护羊踯躅的科学依据，即羊踯躅 Shannon多样性指数(I)为1.768，基因多样性指数Η为0.777，江西省金溪县居群的遗传变异 最丰富，而福建政和的遗传多样性水平最低，见表2，PCA分析和UPGMA分析都表明8个自然群 体被分为两组，江西永修居群独立为一组，羊踯躅最好以就地保护为主，应优先保护金溪、 永修居群，同时增加对政和和京山居群的保护权重。
【专利摘要】本发明公开了一种濒危羊踯躅多态性SSR分子标记开发与应用的方法，利用简化基因组测序技术开发得到11,687对羊踯躅SSR分子标记，从中鉴定获得了16对多态性SSR分子标记，它们能够检测到羊踯躅基因组的SSR位点信息，其有效等位基因数范围为3-15个，杂合度(He)范围为0.489-0.908。本发明提供一批可用于群体遗传学、系统发生学及保护生物学等研究的SSR引物，应用这些多态性SSR分子标记能评估分析濒危羊踯躅遗传多样性和遗传结构，为该物种的保护提供科学依据和参考。
【IPC分类】C12N15/11, C12Q1/68
【公开号】CN105624282
【申请号】CN201510883572
【发明人】罗向东, 程马龙, 戴亮芳, 田欢, 谢建坤
【申请人】江西师范大学
【公开日】2016年6月1日
【申请日】2015年12月4日