为本发明实施例1中纯化重组蛋白化21(pETGL_0002189)与S2免疫血清反应 检测结果;其中，M为蛋白质marker; 1为化21; 2为化21 (祀TGL_0002189)自然感染血清反应； 3为化21(祀TGL_0002189)S2免疫血清反应。
[0034] 图18为本发明实施例1中纯化蛋白化21 (PETBP26)与S2免疫血清反应检测结果;其 中，M为蛋白质marker; 1为化21; 2为化21 (PETBP26)自然感染血清反应;3为化21 (PETBP26) S2免疫血清反应。
[0035] 图19为本发明实施例2中GL_0002189抗原IELISA敏感性和特异性分析。
[0036] 图20为本发明实施例2中BP26抗原IELISA敏感性和特异性分析。
[0037] 图21为本发明实施例2中GL_0002189抗原IELISA检测羊血清的ROC曲线图。
[0038] 图22为本发明实施例2中BP26抗原IELISA检测羊血清的ROC曲线图。
【具体实施方式】
[0039] W下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例 均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册（Sambrook J&Russell DW, Molecular cloning:a Iaboratoiy manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。
[0040] 实施例1 S2疫苗株基因 GL_0002189W及布鲁氏菌BP26基因的克隆、原核表达
[0041] 通过S2疫苗株全基因组测序，预测出的编码基因与已公布的布鲁氏菌基因组数据 比对分析，找出与羊种和牛种布鲁氏菌相比较S2特有基因，用PCR方法从S2基因组中扩增出 52疫苗株的特有基因61_0002189(569 10齡.2)，同时^布鲁氏菌8?26基因（569 10齡.3) 作为对照基因，克隆测序后，构建到原核表达载体祀T30中，转化至E. COl i化2UDE3)，进行 诱导表达，用western-bloting法验证GL_0002189和BP26两个重组蛋白的免疫原性。
[0042] 1.1实验方法：
[00创 1.1.1引物设计
[0044] 根据GL_0002189和BP26基因序列，用01igo6.0设计引物，分别在上游引物和下游 引物中插入EcoR I、Xho I酶切位点，引物的合成由华大基因有限公司完成，引物序列见表 Io
[0045] 表1 GL_0002189和BP26基因引物序列
[0046]
[0047] 1.1.2基因组DNA提取
[004引按照Axygen核酸提取试剂盒步骤操作。
[0049] 1.1.3GL_0002189基因 PCR 扩增
[0化0] 将S2疫苗株GL_0002189基因与NCBI公布的其它种布鲁氏菌进行化AST比对分析， 然后进行PCR扩增和特有性验证。PCR扩增反应条件为:预变性95 °C5min;变性94 °C Imin，退 火60°C Imin，延伸72°C 1.5min，35个循环;再延伸72 °C IOmin dPCR扩增结束后，进行琼脂糖凝 胶电泳检测。
[0化1] 1.1.4目的基因扩增
[0052]目的基因 PCR扩增，进行凝胶琼脂糖电泳检测。具体反应条件如1.1.3描述。
[0053] 1.1.5PCR 产物回收
[0054] 按照Axygen PCR产物回收试剂盒说明书步骤操作，回收化_0002189和化26基因 PCR产物。
[0化5] 1.1.6PCR回收产物与PMD19-T Simple载体的连接
[0化6]取200化离屯、管加化L PMD19-T Simple Vector、化L PCR回收产物、5化 Solution I，离屯、混匀，并在16°C过夜连接。
[0化7] 1.1.7重组质粒的转化
[0化引按照北京全式金(TransGen Biotech)生物技术有限公司化ansI-Tl感受态细胞使 用说明书操作步骤，将连接产物转化于化ansl-Tl感受态细胞中，涂布于含抗生素(Amp)的 固体LB培养基上，37 °C培养过夜。
[0化9] 1.1.8重组克隆菌菌液PCR鉴定
[0060]挑取阳性菌落，接种到含抗生素(Amp)的液体LB培养基里中培养过夜，培养物做 PCR扩增鉴定。
[0061 ] 1.1.9重组克隆质粒的双酶切鉴定
[0062] 按照Axygen质粒提取试剂盒说明书提取重组质粒，用限制性内切酶化〇1和EcoR I 对重组质粒进行双酶切电泳检测。
[0063] 1.1.10重组克隆菌测序
[0064] 经PCR鉴定及质粒双酶切鉴定后的重组克隆菌，送到北京华大基因公司进行双向 测序。
[00化]1.1.11目的基因与表达载体祀T30a的回收
[0066] 将测序正确的克隆菌株和含有祀T30a质粒的菌接种于LB培养基中培养过夜，提取 质粒，回收目的基因片段和祀T30a片段。
[0067] 1.1.12目的基因与表达载体祀T30a的连接
[006引取20化L离屯、管加入化L回收的目的片段、2化祀T30a表达载体片段、化L T4DNA连 接酶、化L buffer, 16°C连接过夜。
[0069] 1.1.13重组质粒转化于感受态细胞
[0070] 按照北京全式金(TransGen Biotech)生物技术有限公司化21 (DE3)感受态细胞使 用说明书操作步骤，将连接产物转化于化2UDE3)感受态细胞中，涂布于含抗生素化an)固 体LB培养基上37 °C培养过夜。
[0071] 1.1.14重组表达菌菌液PCR鉴定
[0072] 具体步骤见1.1.8。
[0073] 1.1.15重组表达质粒的双酶切鉴定
[0074] 具体步骤见1.1.9。
[00巧]1.1.16重组表达菌诱导表达
[0076] 1.1.16.1诱导表达时间的优化
[0077] 将重组表达菌化21 (pETGL_0002189)、BL21 (祀TBP26)涂布于含Kan的固体LB培养 基上培养过夜，挑取单菌落接种在6mL含Kan液体培养基中，37 °C培养过夜。第二天W1:100 的比例接种于20mL含Kan LB培养基中，37°C 15化/min诱导培养，当ODsoo达到0.6~1.0时ImL 菌液作为化对照，其余的培养物里加入IPTG诱导剂，至终浓度1.OmM, 37°C15化/min诱导培 养。分别在化、化、2h、化、地、化每个时间点各取2血菌液，ImL测吸光值ODsoo，另ImL离屯、收集 菌体，菌体沉淀物中加入蛋白上样缓冲液煮沸变性1 Omin，12 % SDS-PAGE电泳检测。
[007引1.1.16.2诱导剂IPTG浓度的优化
[00巧]将重组表达菌化21 (pETGL_0002189)、BL21 (祀TBP26)涂布于含Kan固体LB培养基 上培养过夜，挑取单菌落接种在6mL含Kan的液体培养基里，37 °C培养过夜。第二天W1:100 的比例接种于20mL含Kan的LB培养基中，37 °C 15化/min培养，当ODsoo达到0.6~1.0时，加入 诱导剂 IPTG 至终浓度 0.05111]\1、0.1111]\1、0.2111]\1、0.5111]\1、1.0111]\1、2.0111]\1。37°(：15化/111111继续培养 地，各取2血菌液，ImL测吸光值ODsoo，另1血离屯、收集菌体，菌体沉淀物中加入蛋白上样缓冲 液煮沸变性1 Omin，12 % SDS-PAGE电泳检测。
[0080] 1.1.16.3诱导表达溫度的优化
[0081 ] 将重组表达菌化21(pETGL_0002189)、BL21(祀TBP26)涂布于含Kan固体LB培养基 上培养过夜，挑取单菌落接种在6mL含Kan液体培养基里，37 °C培养过夜。第二天W1:100接 种于20mL含Kan的LB培养基中，37°C 15化/min培养，当ODsoo达到0.6~1.0时加入IPTG诱导剂 至终浓度1 .OmM,分别在25°C、30°C、37°C15化/min培养4h后各取2mL菌液，ImL测吸光值 0化00，另ImL离屯、收集菌体，菌体沉淀物中加入蛋白上样缓冲液煮沸变性IOmin，12 % SDS-PAGE电泳检测。
[0082] 1.1.16.4重组蛋白表达形式的检测
[0083] 确定重组蛋白最佳诱导条件后，诱导表达300mL重组菌，离屯、收集菌体，将菌体沉 淀用PBS洗3遍后，用PBS重悬浮沉淀，加入溶菌酶，常溫放置化，在-20°C反复冻融，冰浴超声 破碎IOmin，12000 Xg离屯、IOmin，收集沉淀和上清，加入蛋白上样缓冲液煮沸IOmin，12% SDS-PAGE电泳检测蛋白表达形式。
[0084] 1.1.17重组蛋白包涵体溶解及纯化
[00化]按最佳诱导条件诱导重组表达表达菌SOOmL ,12000