化好的两个重组蛋白用包被液进行稀释，稀释梯 度为1:25、1:50、1:100、1:200四个梯度，抗原初始浓度分别为GL_0002189(0.421mg/mL)、 BP26(0.553mg/ml)，每孔加100山，4°C包被过夜，第二天弃掉孔内液体，用洗涂液洗S次，每 次静置5min，洗涂结束后拍干酶标板孔内的液体。每孔加10化1封闭液，在37°C放置化，用洗 涂液洗=次，每次静置5min，洗涂结束后拍干酶标板孔内的液体。将已知阳性、阴性血清按 1:50、1:100、1:200、1:400的四个梯度进行稀释，每孔加10化1稀释好的血清，37°C放置化， 用洗涂液洗S次，每次静置5min，洗涂结束后拍干酶标板孔内的液体。每孔加10化1按1: 7000稀释的驴抗绵羊IgG-皿P，37°C放置30min，用洗涂液洗S次，每次静置5min，洗涂结束 后拍干酶标板孔内的液体。每孔加10化1 TMB显色液，37°C显色lOmin。显色结束后，每孔加 IOOiil终止液终止反应，并在酶标仪上读取0D4日日值。根据0D4日日值计算每组的P/N值，P/N =实 验组/对照组=OD阳性血清/OD阴性血清，P/N值最大时所对应的抗原稀释度和血清稀释度 为最佳稀释度。
[0124] 2.1.2二抗最佳最佳浓度的确定
[0125] 按照棋盘滴定法，将纯化好的两个重组蛋白用包被液进行稀释，稀释梯度为1:25、 1:50、1:100、1:200四个梯度，抗原初始浓度分别为化_0002189(0.421mg/mL)、BP26 (0.553mg/ml)，按上述操作方法进行抗原包被、洗涂、封闭和阴阳性血清的稀释，驴抗绵羊 IgG-皿P按 1:5000、1:7500、1:10000、1:15000四个梯度稀释，每孔加 IOOiU，进行IELISA试 验。根据OD450值计算每个二抗稀释度的P/N值，P/N值最大时所对应的二抗稀释度即为最佳 二抗稀释度。
[0126] 2.1.3重复性实验
[0127] 对2份阳性血清和2份绵羊阴性血清进行检测，每个样品重复3次，计算每个样品标 准差。
[012引 2.1.4判定点的确定
[01巧]GL_0002189和BP26抗原检测20份背景清楚的自然感染血清及30份S2免疫血清，通 过SPSS软件ROC分析，确认两个重组抗原IELISA判定点。
[0130] 2.1.5敏感性和特异性实验
[0131] GL_0002189和BP26抗原检测20份背景清楚的自然感染血清及30份S2免疫血清，通 过SPSS软件分析，确认两个重组抗原IELISA敏感性和特异性。
[0132] 2.1.6田间实验
[0133] 将待检的血清进行IELISA检测，比较两种抗原的阳性检出率。
[0134] 2.2实验结果
[0135] 2.2.1最佳包被浓度和最佳血清稀释度的确定
[0136] 将纯化好的GL_0002189和化26抗原按四个梯度稀释，已知阳性血清和阴性血清按 四个梯度稀释，进行IELISA检测，根据IELISA显色后的颜色和OD450值能看出阳性、阴性血清 颜色和OD450值大小存在明显差异，结果见表3、表4。根据P/N值计算出抗原最佳包被浓度为 1:100,血清最佳稀释度为1:100,结果见表5、表6。
[0137] 表3 GL_0002189抗原棋盘滴定0D4加值
[013 引
[01：
[01'
[01'
[01'
[01'
[01'
[01' 123 2.2.2酶标二抗最佳稀释度的确定 2 根据IELISA显色终止反应的颜色及计算P/N值大小，确定酶标二抗最佳稀释度为 1:7500,结果见表7、表8。 3 表7 GL_0002189酶标二抗最佳工作浓度的确定
[0149]
[0150]
[0151]
[0152] 2.2.3重复实验
[0153] 选取2份阳性血清和阴性血清，用两种重组抗原IELISA检测，每个样品重复3次。3 次重复OD450差异不明显，表明两种重组抗原建立的IELISA检测方法均具有较好的重复性， 结果如表9。
[0154] 表9重组抗原重复实验0D45G值及SD值
[0155]
[0156] 2.2.4判定点的确定
[0157] GL_0002189和BP26抗原用iELISA法检测血清，OD450值结果见表10、表11。利用SPSS 软件根据0D45Q值进行ROC分析，确定重组抗原化_0002189iELISA判定点为0.57,重组抗原 BP26iELISA判定点为0.589，判定点分析见图19、图20。重组抗原61^_00021891?0(：分析曲线下 面积为0.987，重组抗原BP26R0C分析曲线下面积为0.987，2个重组抗原ROC分析曲线下面积 均接近1，说明2个重组抗原iELISA检测法可靠性高，结果见图21、图22。
[015引 表.10 GL_0002189判定点004加值
[0159] LU I U立」 乙.乙.U干守升I工取;拟I工乂T W I
[0163] GL_0002189和BP26抗原检测20份背景清楚的布鲁氏菌自然感染血清及30份布鲁 氏菌S2免疫血清，通过SPSS软件分析发现重组抗原GL_0002189IELISA敏感性为95%、特异 性为95%，重组抗原BP26IELISA敏感性为90%、特异性为86.7%，具体结果见图19、图20。
[0164] 2.2.6田间实验
[01化]对180份SAT及RBPT检测呈阳性的布鲁氏菌感染血清进行IELISA检测，^化_ 0002189抗原检测出61个阳性，BP26检测出176个阳性，说明180份血清中有61个为S2疫苗抗 体阳性绵羊。GL_0002189抗原IELISA检测方法检出S2疫苗抗体阳性率为33.8% (61/180)， 而BP26抗原IELISA检测方法检出阳性率为98.8% (176/180)，说明在SAT及RBPT检测呈阳性 的家畜中，存在疫苗抗体干扰检测的假阳性。GL_0002189可用于布鲁氏菌S2疫苗感染与羊 种/牛种布鲁氏菌自然感染的鉴别诊断，结果见表12。
[0166] 表12田间实验结果
[01A71
[0168] 可见，本发明建立的IELISA鉴别检测方法能鉴别S2疫苗免疫与自然感染的布鲁氏 菌病，且该方法具有较好的重复性及较高的特异性和敏感性。
[0169] 虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在 本发明基础上，可W对之作一些修改或改进，运对本领域技术人员而言是显而易见的。因 此，在不偏离本发明精神的基础上所做的运些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
【主权项】
1. GL_0002189抗原蛋白，其特征在于，其氨基酸序列如Seq IDNo.l所示，或该序列经替 换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。2. 权利要求1所述GL_0002189抗原蛋白的编码基因。3. 用于扩增权利要求2所述基因的特异性PCR引物。4. 权利要求1所述GL_0002189抗原蛋白在制备家畜S2疫苗免疫与羊/牛种布鲁氏菌感 染的IELISA检测试剂中的应用。5. 家畜S2疫苗免疫与羊/牛种布鲁氏菌感染的IELISA检测试剂，其特征在于，所述 IELISA检测试剂的有效成分为权利要求1所述GL_0002189抗原蛋白以及布鲁氏菌BP26蛋 白，或者它们的N端或C端融合有His标签的重组蛋白。6. 鉴别家畜S2疫苗免疫与羊/牛种布鲁氏菌感染的胶体金试纸条，其特征在于，所述试 纸条上包被有权利要求1所述GL_0002189抗原蛋白以及布鲁氏菌BP26蛋白，或者它们的N端 或C端融合有His标签的重组蛋白。7. 家畜S2疫苗免疫与羊/牛种布鲁氏菌感染的IELISA检测试剂盒，其特征在于，所述试 剂盒中包含权利要求6所述的IELISA检测试剂。
【专利摘要】本发明提供一种家畜S2疫苗免疫与羊/牛种布鲁氏菌感染的IELISA检测试剂，所述IELISA检测试剂的有效成分为布鲁氏菌S2疫苗株基因GL_0002189编码的抗原蛋白以及布鲁氏菌BP26蛋白，或者它们的N端或C端融合有His标签的重组蛋白。本发明提供的IELISA检测试剂能鉴别布鲁氏菌主要流行株—羊种/牛种布鲁氏菌及市场上普遍使用的主流疫苗—S2疫苗。因此，能够在短时间内鉴别家畜血清中疫苗免疫与羊种/牛种布鲁氏菌自然感染抗体，解决免疫畜群中疫苗抗体干扰布病检测和畜群净化的难题。不仅可带来,社会经济效益，而且可为净化畜群中的布鲁氏菌病做出贡献。
【IPC分类】G01N33/68, C07K14/23, C12N15/31, G01N33/569, C12N15/11
【公开号】CN105693831
【申请号】CN201610084616
【发明人】王文龙, 红梅, 呼和巴特尔, 刘春霞, 刘宁
【申请人】内蒙古农业大学
【公开日】2016年6月22日
【申请日】2016年2月6日