39] 下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会 理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体 条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为 可W通过市购获得的常规产品。
[0040] 实施例1:水稻抗咪挫嘟酬类除草剂突变体获取过程(百垄通）
[0041] 将釉型常规水稻9311种子(购自江苏省农业种质资源保护与利用平台）（此为MO, 用清水浸泡2小时）150kg分6次用0.5-1.0% (w/w)甲横酸乙醋(EMS)室溫下浸泡6-9小时，期 间每1小时摇动一次种子;弃去EMS溶液，自来水翻动浸泡种子5次，每次5分钟，然后用自来 水冲洗种子过夜，次日进行田间播种，并进行常规肥水管理(此为Ml)。植株成熟后，种子混 收、惊干，过冬保存。次年播种田间。待水稻(此为M2)幼苗长至3-4叶期时，喷施为SmL百垄 通/L水r百垄通"是德国己斯夫公司生产一种水剂型咪挫嘟酬类除草剂，推荐最低使用浓 度为ImL百垄通/1.5~化水），30天后还呈正常绿色植株即为抗咪挫嘟酬类除草剂的水稻突 变植株（图1)。共计获得抗除草剂的M2单株370株，运些抗性单株进行常规肥水管理，有320 个M2单株可正常结实，种子成熟后，单株收种、惊干，过冬保存。
[0042] 实施例2:抗咪挫嘟酬类除草剂水稻突变体突变位点分析
[0043] 取上述实施例1获得的抗除草剂水稻突变植株中选取突变植株1和突变植株2的叶 片，分别提取基因组DNA，送上海翰宇生物科技有限公司进行基因组测序。测序结果与9311 参考基因组序列化ttp: //riseS. genomics. org. cn/page/rice/download. jsp)相比，发现 上述抗除草剂水稻突变体在ALS基因上发生了多个位点的突变，其中抗除草剂突变植株I在 ALS基因的第75、339位点碱基发生突变，分别由G变成C、A变成C，导致其相应编码的氨基酸 序列的第25、113位点由谷氨酷胺变为组氨酸、谷氨酷胺变为组氨酸，即抗除草剂突变植株 的ALS基因的核巧酸序列如SEQ ID NO. 1所示，其编码的ALS蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示;抗除草剂突变植株2在ALS基因的第75、339、710位点碱基发生突变，分别由G变成 C、A变成C、C变成T，导致其相应编码的氨基酸序列的第25、113、237位点分别由谷氨酷胺变 为组氨酸、谷氨酷胺变为组氨酸、丙氨酸变成鄉氨酸，即抗除草剂突变植株的ALS基因的核 巧酸序列如SEQ ID NO.3所示，其编码的ALS蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。本发明 的突变植株U9311M1)其分类命名为釉型常规水稻9311(0巧za sativa indica Group CUltivar 9311)的抗除草剂突变体，该菌株已于2016年3月30号保藏于中国微生物菌种保 藏管理委员会普通微生物中屯、（CGMCC)，地址:北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学 院微生物研究所，邮编：100101，保藏编号为CGMCC No. 12265。本发明的突变植株2(9311M2) 其分类命名为釉型常规水稻931 UOiyza sativa indica Group cultivar 9311)的抗除草 剂突变体，该菌株已于2016年3月30号保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物 中屯、（CGMCC)，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编： 100101，保藏编号为CGMCC No. 12266。该保藏的水稻种子与普通水稻种子的培养条件一致， 喜高溫、多湿、短日照，对±壤要求不严，在20-32°C、湿润的±壤(pH 5.5-7.5)、正常日照条 件下都可较好地生长。将水稻种子用清水浸泡后，置于恒溫培养箱25-3(TC培养48小时，早 晚各换一次水;接着将水稻种子放在垫有湿纱布的平皿中，盖上盖子，放在恒溫培养箱25-30°C培养，大约3-4天就可检测发芽情况。
[0044] 实施例3抗咪挫嘟酬类除草剂水稻突变体ALS基因克隆
[0045] 取上述抗除草剂水稻突变体931 IMl和9311M2的叶片，分别提取基因组DNA。根据 9311水稻野生型ALS基因（BAC克隆Genbank登录号AAAA02006431.1)所在的染色体序列设计 扩增ALS基因3 '端序列的特异引物为:正向引物3F5 ' -GGTCTTGCGTCTGGTTGGCGAGT-3 '、反向 引物3R 5'-CTCTTTATGGGTCATTCAGGTCAA-3'，设计扩增ALS基因5'端序列的特异引物为：正 向引物5F 5 ' -ATCCGAGCCACACATCGCCTCAC-3 '，反向引物5R5 ' -AGCAACAGGTCAGCCTTATCCAC-3'。该两对特异引物扩增的序列有23化P的重叠部分，可W拼接成完整的ALS基因序列。
[0046] 采用!"akara PrimerSTAR Max DNA Polymerase聚合酶（购自！"akara公司）扩增ALS 基因5'端序列、3'端序列，其反应体系如下：
[0047]
[004引 PCR扩增反应程序采用两步法，退火和延伸合为一起，采用68度。
[0049] 程序如下：预变性:98 °C 3min; 35个循环:变性98 °C IOsec;延伸68 °C Imin;保溫:72 °C IOmin。
[0050] 取化1 PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，发现有预期大小的片段后（图2、图3)， 剩余的PCR产物经PCR清洁试剂盒(购自Axygen公司）清洁回收后，克隆至PMD19-T载体(购自 化kara公司），然后转化大肠杆菌。每个转化随机挑取12个大肠杆菌单克隆进行PCR检测，取 PCR结果呈阳性的6个单克隆，送金斯瑞生物科技有限公司测序，获得突变ALS基因序列。 [0051 ]实施例4水稻M3突变体抗咪挫嘟酬类除草剂(百垄通）
[0化2] 将9311M1和9311M2收获的种子播种出苗(此为M3)，待M3水稻幼苗长至3-4叶期时， 喷施4mL百垄通/L水(推荐最低使用浓度为ImL百垄通/化水，相当于12倍浓度）。喷施除草剂 15天后，抗性苗M3呈正常绿色、能继续长高至20-30cm，而非抗性苗叶片失去绿色甚至部分 枯黄，植株不长高，只有5-9畑1。30天后，M3抗性株呈正常绿色植株，而喷施同样浓度除草剂 的野生型水稻都已全部枯死，表明突变水稻至少抗12倍浓度的百垄通除草剂。
[0053]实施例5水稻M3突变体抗横酷脈类除草剂（甲喀横隆）
[0化4] 将9311M1和9311M2收获的种子播种出苗(此为M3)，待M3水稻幼苗长至3-4叶期时， 喷施4.5g/L甲喀横隆(帆邦生物科技有限公司生产的水分散粒剂，有效成分75% ;推荐最低 使用浓度为〇.5625g/L，相当于8倍推荐使用浓度）。喷施除草剂15天后，抗性苗M3呈正常绿 色、能继续长高至20-30cm，而非抗性苗叶片失去绿色甚至部分枯黄，植株不长高，只有5-9畑1。30天后，M3抗性株呈正常绿色植株，而喷施同样浓度除草剂的野生型水稻都已全部枯 死，表明突变水稻至少抗8倍浓度的甲喀横隆除草剂。
[0055] 实施例6水稻M3突变体的ALS酶活测定
[0056] 为了验证水稻突变体的除草剂抗性是否由ALS突变所致，本发明人进行了 ALS酶活 性测定。测定方法参照Singh等的方法（Sin曲B.K.,Sti化am M.A.,Shaner D丄.Assay of acetohydroxyacid synthase .Analytical Biochemistry, 1988,171:173-179.)。具体的， 分别取野生型、931 IMl和9311M2的M3植株叶片0.2g，在研鉢中用液氮研磨粉碎，加入2mL提 取液(100mMK2HP04，pH7.5、10mM丙酬酸钢、5mMEDTA、lmM鄉氨酸、lmM亮氨酸、10mM半脫氨 酸、0.1 mM黄素腺嚷岭二核巧酸、5mM氯化儀、10% (V/V)甘油、1 % (w/v)聚乙締化咯烧酬），待 提取液解冻后继续研磨Imin左右。12000巧m、4°C离屯、30min，吸取上清液，加入硫酸锭使之 达到50 %饱和度，于冰上放置半小时，12000巧m、4°C离屯、30min，弃上清，将沉淀溶解于 0.2血反应缓冲液（IOOmM K2HP04，pH 7.0、lmM抓TA、10mM氯化儀、IOOmM丙酬酸钢、ImM焦憐 酸硫胺素、0.1 mM黄素腺嚷岭二核巧酸），分别得各植株的ALS提取液。
[0057] 在获得ALS提取液中分别加入10化除草剂"百垄通"（水剂，有效成分240g/L)，或 Img甲喀横隆（帆邦生物科技有限公司生产的水分散粒剂，有效成分75%)，混匀，37°C解育 化，加O. Iml 3M硫酸终止反应，反应混合物在60°C反应解育30分钟便于脱簇。然后加0.4mL 显色液(0.09g/L 1-糞酪和0.009g/L肌酸，用2.5M化O田容解）。混合液在37°C解育30分钟进 行显色(ALS催化2个丙酬酸形成乙酷乳酸，乙酷乳酸脱簇形成3-径基下酬，再与肌酸和1-糞 酪形成粉红色复合物，该复合物在530nm处有最大吸收值），随后测定其530nm的吸光度，ALS 活性用A530吸光值表示，A530吸光值的高低反映ALS活性的高低。实验W水为对照，野生型、 931 IMl株系和9311M2株系都各测5个单株。
[0化引 A530吸光值测定结果发现，当野生型、931 IMl和9311M2的ALS提取液中没有ALS抑 审IJ剂百垄通时，它们的A530吸光值均在1.2-1.4间，表明野生型和突