五DNA序列；
[0052] S34:连接所述第四DNA序列和所述第五DNA序列，获得第一连接产物；
[0053] 具体地，获得第一连接产物的过程中连接反应的体系为20化，包括:T4DNA连接酶2 化，10倍缓冲液化L，第四DNA序列10化，第五DNA序列化L连接条件为：16 °C，12小时，获得第 一连接产物。
[0054] S35:将第一预设量的所述第一连接产物和第二预设量的化21菌株感受态细胞混 合，转化并筛选培养，获得阳性克隆组；
[0055] 具体地，将20化第一连接产物加入到含有100化北京天根公司生产的商品化的 化21菌株感受态细胞的无菌塑料管中，置于42°C，热激转化90秒，在无菌塑料管中加入80化 L液体培养基，置于37 °C摇床中，培养40分钟，获得第一转化菌液;所述液体培养基成分配方 如下：氯化钢lOg/L，蛋白腺lOg/L，酵母浸粉5g/M所述无菌塑料管经过12rC、20分钟高压 灭菌方法灭菌;将所述第一转化菌液离屯、，去除上清液，获得第二转化菌液；
[0056] 用10化L所述液体培养基重悬所述第二转化菌液并涂布在筛选培养板上，置于37 °C恒溫箱培养箱中培养12小时，获得阳性克隆组。所述筛选培养板由商品化无菌塑料板和 大肠杆菌固体培养基组成;所述大肠杆菌培养基配方如下：氯化钢lOg/L，蛋白腺lOg/L，酵 母浸粉5g/L，琼脂粉15g/L。
[0057] S36:筛选所述阳性克隆组，进行测序验证，获得第一目的克隆组。
[005引S4:将所述第一目的克隆组分别诱导表达，获得第一细菌群；
[0059] 具体地，所述大肠杆菌培养基的配方为:氯化钢lOg/L，蛋白腺lOg/L，酵母浸粉5g/ L；
[0060] 所述诱导表达的条件为:待大肠杆菌培养密度达到0D600 = 0.8-1.0之间时，在培 养基中加入终浓度为0.5mM的IPTG，37°C培养6小时。
[0061] S5:破碎所述第一细菌群，进行纯化，获得基于绿色巧光蛋白发光结构域标记的抗 乙肝表面抗原抗体。
[0062] 具体地，参照图3,图3为本发明较佳实施例中步骤S5的细化流程示意图。所述步骤 S5包括W下步骤：
[0063] S51:超声破碎所述第一细菌群，获得上清液；
[0064] 所述超声破碎的方法为:超声功率200W，工作5秒，间歇8秒;工作环境为0-4°C ;
[0065] 所述超声的时间为30分钟；
[0066] S52:利用儀离子亲和柱纯化所述上清液，获得洗脱液；
[0067] 所述的纯化方法为儀离子亲和纯化；
[0068] 所述儀离子亲和纯化的结合条件为150mM NaCl，300mM Na2HP04，pH7.4;
[0069] 所述儀离子亲和纯化的洗脱条件为150mM化Cl，300mM化2HP04，pH7.4,200m]\ffl^ 挫。
[0070] S53:利用蛋白冻干的方法处理所述洗脱液，获得绿色巧光蛋白发光结构域标记的 抗乙肝表面抗原抗体。
[0071] 为检测上述得到的绿色巧光蛋白发光结构域标记的抗乙肝表面抗原抗体（W下简 称巧光抗体)的识别抗乙肝表面抗原的效率和特异性，我们采取W下实施例对本发明进行 解释，本发明并不局限于W下实施例。
[0072] 利用低浓度的抗乙肝表面抗原作为样品，测试本发明制备的巧光抗体的灵敏度， 具体步骤如下。
[0073] S120:取抗乙肝表面抗原，用憐酸缓冲液(PBS)对抗乙肝表面抗原进行稀释，配制 成浓度为〇ng/mL、0.02ng/mL、0.04ng/mL、0. lng/mL、0.化g/mL、0. ：3ng/mL、0.51ng/mL7个梯 度的抗乙肝表面抗原液备用。
[0074] S130:将所述巧光抗体10化、憐酸缓冲液90化，分别加入到酶标板的8个孔中，在第 8个孔中加入没有巧光标记的抗乙肝表面抗原巧光抗体10化、憐酸缓冲液90化，分别命名为 1，2,3,4,5,6,7,8室溫解育1211。
[0075] S140:将所述S130中的酶标板中的液体吸弃，重新加入10化L憐酸缓冲液至酶标板 中，将所述酶标板置于摇床上，每分钟30rpm，室溫清洗5分钟。
[0076] S150:重复步骤S140两次，并吸弃酶标板中1-8板孔中的憐酸缓冲液。
[0077] S160:在所述酶标板板孔1中加入10化L憐酸缓冲液，在板孔1 -8中分别加入10化浓 度为Ong/血、0.0化g/mL、0.04ng/mL、0. lng/mL、0.化g/mL、0. ：3ng/mL、0.51ng/mL7个梯度的 抗乙肝表面抗原液，其中板孔I为阳性对照，板孔8为阴性对照，板孔2-7为样本组。
[0078] S170:在板孔1-8中分别加入90iiL憐酸缓冲液。把酶标板置于摇床上，按照每分钟 3化pm的速度室溫解育化。
[0079] S180:将S170所述酶标板1-8板孔中的液体吸弃，并在酶标板的1-8板孔中加入100 化PBS，按照每分钟30巧m，室溫清洗5分钟。
[0080] S190:重复 S180 两次。
[0081 ] S200:将所述清洗后的酶标板置于酶标仪上进行检测，550nm激光激发，采集595nm 下的巧光，实验结果如表2所示。
[0082] 实验结果表明，巧光强度和皿SAg的终浓度呈正比，且随着所述抗乙肝表面抗原终 浓度的增加，巧光强度逐渐递增。通过本发明提供的绿色巧光蛋白发光结构域标记的抗乙 肝表面抗原抗体的制备方法，利用绿色巧光蛋白发光结构域的巧光强度作为抗乙肝表面抗 原抗体在检测酶标板上分散的均匀度和抗体稳定性的参照，
[0083] 提高了乙肝表面抗原定量检测的准确性。
[0084] 表2本发明制备的巧光抗体检测抗乙肝表面抗原的浓度与巧光强度对照表
[0085]
[0086] W上仅为本发明的优选实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发 明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技 术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。
【主权项】
1. 一种基于绿色荧光蛋白发光结构域标记的抗乙肝表面抗原抗体的制备方法，其特征 在于，所述基于绿色荧光蛋白发光结构域标记的抗乙肝表面抗原抗体的制备方法包括如下 步骤： S1:合成融合基因 GFP-F-Domain-anti-HBsAg 的第 一DNA 序列； S2:以所述第一DNA序列为模板，扩增所述第一DNA序列，获得第二DNA序列； S3:将所述第二DNA序列连接至表达载体pET22b质粒，获得第一目的克隆组； S4:将所述第一目的克隆组分别诱导表达，获得第一细菌群； S5:破碎所述经过诱导表达的第一细菌群，进行纯化，获得基于绿色荧光蛋白发光结构 域标记的抗乙肝表面抗原抗体。2. 如权利要求1所述的基于绿色荧光蛋白发光结构域标记的抗乙肝表面抗原抗体的制 备方法，其特征在于，所述步骤S3包括如下步骤： S31:纯化第二DNA序列，获得第三DNA序列； S32:利用限制性内切酶处理所述第三DNA序列，获得第四DNA序列； S33:利用限制性内切酶处理表达载体pET22b质粒，获得线性化的pET22b质粒，即第五 DNA序列； S34:连接所述第四DNA序列和所述第五DNA序列，获得第一连接产物； S35:将第一预设量的所述第一连接产物和第二预设量的BL21菌株感受态细胞混合，转 化并筛选培养，获得阳性克隆组； S36:筛选所述阳性克隆组，进行测序验证，获得第一目的克隆组。3. 如权利要求1或2所述的基于绿色荧光蛋白发光结构域标记的抗乙肝表面抗原抗体 的制备方法，其特征在于，所述步骤S5包括如下步骤： S51:超声破碎所述第一细菌群，获得上清液； S52:利用镍离子亲和柱纯化所述上清液，获得洗脱液； S53:利用蛋白冻干的方法处理所述洗脱液，获得基于绿色荧光蛋白发光结构域标记的 抗乙肝表面抗原抗体。4. 如权利要求1或2所述的基于绿色荧光蛋白发光结构域标记的抗乙肝表面抗原抗体 的制备方法，其特征在于，所述步骤S2中扩增所述第一 DNA序列的引物GFP-F-Domain-anti-HBsAg-F的DNA序列为atgccaacacttgtcactac，引物GFP-F-Domain-anti-HBsAg-R的DNA序列 为cttgacttcagcacggtc。5. 如权利要求1或2所述的基于绿色荧光蛋白发光结构域标记的抗乙肝表面抗原抗体 的制备方法，其特征在于，所述融合基因 GFP-F-Domain-anti-HBsAg的第一 DNA序列包括位 于所述融合基因 GFP-F-Domain-anti-HBsAg的5'端的编码绿色荧光蛋白GFP发光结构域的 DNA序列、位于3'端的编码anti-HbsAg蛋白的DNA序列，以及位于5'端和3'端之间的连接肽 DNA序列。6. 如权利要求1或2所述的基于绿色荧光蛋白发光结构域标记的抗乙肝表面抗原抗体 的制备方法，其特征在于，所述融合基因 GFP-F-Domain-anti-HBsAg的第一 DNA序列为单链 DNA序列。7. 如权利要求2所述的基于绿色荧光蛋白发光结构域标记的抗乙肝表面抗原抗体的制 备方法，其特征在于，所述限制性内切酶为Ndel和Xhol。8. 如权利要求2所述的基于绿色荧光蛋白发光结构域标记的抗乙肝表面抗原抗体的制 备方法，其特征在于，所述第一预设量为20yL，所述第二预设量为lOOyL。9. 如权利要求2所述的基于绿色荧光蛋白发光结构域标记的抗乙肝表面抗原抗体的制 备方法，其特征在于，连接所述第四DNA序列和所述第五DNA序列时的温度为16 °C。
【专利摘要】本发明公开了一种基于绿色荧光蛋白发光结构域标记的抗乙肝表面抗原抗体的制备方法。该制备方法通过基因工程手段，包括如下步骤：合成融合基因GFP?F?Domain?anti?HBsAg的第一DNA序列；以所述第一DNA序列为模板进行扩增，获得第二DNA序列；将所述第二DNA序列连接至表达载体pET22b质粒上，获得第一目的克隆组；将所述第一目的克隆组分别诱导表达，获得第一细菌群；将所述经过诱导表达的第一细菌群破碎、纯化，获得基于绿色荧光蛋白发光结构域标记的抗乙肝表面抗原抗体。通过本发明提供的制备方法提高了乙肝表面抗原定量检测的准确性。
【IPC分类】C07K1/14, C07K19/00, C12N15/70
【公开号】CN105713917
【申请号】CN201610096057
【发明人】周晓莹, 胡立夫, 英格玛·恩伯格, 埃姆郎·纳瓦什
【申请人】深圳市圣必智科技开发有限公司
【公开日】2016年6月29日
【申请日】2016年2月20日