一种可溶性碱性成纤维细胞生长因子融合蛋白表达载体及其应用
【专利摘要】本发明公开了一种可溶性碱性成纤维细胞生长因子融合蛋白表达载体及其应用，所述表达载体克隆区上游包含人类游离脂肪酸结合蛋白(FABP6)的编码序列，下游为人类碱性成纤维细胞生长因子的编码序列，两个基因的编码区之间包含一段柔性接头编码序列，FABP6的氨基端包含His?Tag标签编码序列。本发明提供了一种新型碱性成纤维细胞生长因子融合蛋白表达载体，其特点是：1)可溶性蛋白与包涵体蛋白的比值大于70％；2)容易借助组氨酸标签(His?Tag)亲和纯化获得目标蛋白。
【专利说明】
-种可溶性碱性成纤维细胞生长因子融合蛋白表达载体及其 应用
技术领域
[0001] 本发明设及一种可溶性细胞因子蛋白表达技术，尤其是设及一种可溶性人碱性成 纤维细胞生长因子融合蛋白表达载体及其应用，属于分子生物学基因工程领域。
【背景技术】
[0002] 早在1940年，Hoftman等在脑和垂体的抽提物中发现一种能够促进成纤维细胞生 长的物质。1974年该物质被分离纯化，并命名为成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factor, FGF)。接着，人们又分离出一种与之高度同源的物质，由于它含有较多的酸性氨基 酸碱基，等电点为酸性(pi = 5.6)，故命名为酸性FGF(aFGF)。先发现的FGF因对酸和热敏感， 等电点偏碱(PI = 9.6)，则称为碱性FGF (bFGF)。aFGF和bFGF与后发现的int-2、FGF-5、角质 细胞生长因子化GF/FGF-7)、hst-1 Af gf、FGF-6等同属于FGF家族。
[0003] 随着bFGF的高度纯化(Bohlen，1984)、测序巧sch，1985 ,Simpson，1987)和DNA克隆 成功（Araham，1986 ,Gospodarowicz，1984)引入肝素-琼脂糖亲和层析提纯bFGF,可得到 90 % W上纯度，从此bFGF的研究进入了新的阶段。
[0004] bFGF是含155个氨基酸的促有丝分裂的碱性蛋白质，其氨基酸序列与aFGF有55% 的同源性，但其生物学活性比aFGF强30-100倍。bFGF分子量为16~18.5KD。bFGF分子结构中 有4个半脫氨基酸(切S)，用丝氨酸取代半脫氨酸，bFGF的生物学活性不变，更容易在大肠杆 菌中表达。
[0005] bFGF成熟肤的簇基端较氨基端更稳定，将氨基端截去24个氨基酸时，尚不影响其 生物学活性。bFGF在生物进化上具有很强的保守性，人和牛的bFGF蛋白同源性达98.7%。
[0006] bFGF主要分布于脑垂体、脑和神经组织及视网膜、肾上腺、胎盘等部位，W垂体组 织含量最高，每公斤垂体组织可纯化bFGF 0.5mg，其它组织含量很少，约为其1/10~1/50。 bFGF不存在或W极低浓度存在于血清和体液中。
[0007] bFGF作为细胞分裂原，主要作用在起源于中胚层和神经外胚层的骨骼肌细胞、成 纤维细胞和骨细胞等，其受体也相应的分布于上述细胞表面。FGF存在两类受体:一类是亲 和力受体，属跨膜性酪氨酸蛋白激酶类受体;另一类是低亲和力受体，即肝素样受体，为硫 酸乙酷肝素蛋白多糖类物质。
[000引bFGF通过与祀细胞上的受体结合而发生作用，因此细胞内合成的bFGF需分泌至细 胞外才能发挥生物学效应。但bFGF的mRNA翻译产物缺少引导它们向细胞外分泌的信号序 列，其分泌途径与经典途径不同，除了可能是细胞受损或死亡后释出，还有自分泌和旁分泌 起作用。
[0009] bFGF与受体结合后，能通过W下途径将信号传导到细胞核，从而调控基因表达：
[0010] (1)激活腺巧酸环化酶与鸟巧酸环化酶，憐脂酶C^LC-rl)憐酸化，又使憐脂酷肌 醇-4,5二憐酸(PIP2)分解为甘油二醋(DG)和S憐酸肌醇（IP3)，导致蛋白激酶C激活和化化 内流；
[0011] (2)与受体结合后定位于细胞核，影响RNA聚合酶I，加强核蛋白体基因的转录，W 加速细胞由GO^Gl和^Gl^S期的转换，刺激细胞的DNA合成增强，促进细胞的分裂与增殖； [001^ (3)bFGF与FGFR复合物的内部化。
[0013] 现今资料表明，bFGF的生物学作用极其广泛，它在组织修复、促进创伤愈合与血管 形成、促进组织再生和神经组织生长发育过程中起着十分重要的作用。bFGF的生物学效应 分体内和体外两大部分。体外作用十分强烈，成纤维细胞、骨细胞、软骨细胞、血管内皮细 胞、肾上腺皮质和髓质细胞、神经元和神经胶质细胞等具有很强的促细胞分裂增殖活性。体 外细胞培养中能在低浓度（Img ? ml-1)发挥其作用。bFGF是重要的促有丝分裂因子，也是 形态发生和分化的诱导因子。其主要生物学作用有：（1)作为血管生长因子；（2)促进创伤愈 合与组织修复；（3)促进组织再生；（4)参与神经再生等。
[0014] bFGF在体内含量甚微，但分布广泛，生理功能复杂多样。bFGF生物活性的多效性W 及神经营养的广谱性，为其从基础走向临床提供了保证。在皮肤衰老的修复和预防皮肤衰 老的研究中，神经-体液因子的联合营养调控早已得到认证。肢体神经损伤，肢体萎缩;皮肤 神经末稍萎缩或功能异常，皮肤松弛，感觉迟纯，营养障碍，出现神经性皮炎、色素沉着、色 斑、或老年斑。皮肤表面的临床使用证明，少量的吸收(毛囊或汗腺口），经过一段时间后，皮 肤质感丰实，皱纹减少、沟纹变浅。运些发现使得bFGF在日用护肤抗衰领域拓开了巨大的应 用前景。
[001引目前，国际日化名牌极少有bFGF的添加，添加表皮生长因子巧GF)的居多，EGF使表 皮新生、眼观嫩丽，但对深层结缔组织作用较弱，修复能力不够，配合bFGF联合应用，将形成 全方位皮肤抗衰调控，由内向外、由里及表的全层维持细胞与组织的优良状态;不仅表皮代 谢旺盛、皮下成纤维细跑合成和更新胶原蛋白过程也加强，皮肤的血液供应改善，神经末稍 功能得W适当维护，神经-体液的双重营养得到提高，运将是医学生理学需要的全方位仿生 生物学皮肤抗衰老科学。
[0016] 随着bFGF在医药和日化领域的应用市场扩大，对bFGF的需求量快速上升，目前常 见的原核细胞bFGF基因表达工程获得的bFGF因子，可溶性低，包涵体多，经常借助体外复 性，造成产量低、活性低、工艺繁，不利于大工艺生产。
【发明内容】
[0017] 鉴于W上bFGF的生产与应用问题，本发明的目的在于提供一种可溶性碱性成纤维 细胞生长因子融合蛋白。
[0018] 本发明的另一目的在于提供一种可溶性碱性成纤维细胞生长因子融合蛋白表达 载体，W提高可溶性bFGF的表达产量。
[0019] 本发明的又一目的在于提供上述可溶性碱性成纤维细胞生长因子融合蛋白表达 载体的应用。
[0020] 本发明通过W下技术方案得W实现：
[0021] -种可溶性碱性成纤维细胞生长因子融合蛋白，是如下（1)或(2)的蛋白质：
[0022] (1)由脂肪酸结合蛋白FABP和碱性成纤维细胞生长因子蛋白融合得到的融合蛋 白；
[0023] 所述的脂肪酸结合蛋白FABP是FABPl~FABP9中的任意一种或亚种，所述FABPl~ FABP9的氨基酸序列如下所示：
[0024] 所述的FABPl为氨基酸序列如SEQ ID NO: 1所示的蛋白质；
[0025] 所述的FABPl-I为氨基酸序列如SEQ ID N0:2所示的蛋白质；
[00%] 所述的FABP1-2为氨基酸序列如SEQ ID N0:3所示的蛋白质；
[0027]所述的FABP2为氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示的蛋白质；
[002引所述的FABP3为氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示的蛋白质；
[0029] 所述的FABP4为氨基酸序列如SEQ ID N0:6所示的蛋白质；
[0030] 所述的FABP5为氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示的蛋白质；
[0031] 所述的FABP6为氨基酸序列是SEQ ID N0:8第2~127位氨基酸残基所示的蛋白质；
[0032] 所述的FABP7为氨基酸序列如SEQ ID N0:9所示的蛋白质；
[0033] 所述的FABP8为氨基酸序列如SEQ ID NO: 10所示的蛋白质；
[0034] 所述的FABP9为氨基酸序列如SEQ ID NO: 11所示的蛋白质；
[0035] 或者，为将SEQ ID N0:1~11所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取 代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由其衍生的蛋白质；
[0036] 所述碱性成纤维细胞生长因子蛋白为氨基酸序列如SEQ ID N0:12所示的蛋白质， 或者为将SEQ ID NO: 12所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失 和/或添加且具有相同功能的由其衍生的蛋白质；
[0037] 所述的脂肪酸结合蛋白FABP和碱性成纤维细胞生长因子蛋白通过柔性接头连接；
[0038] (2)将(1)的N端连接组氨酸标签得到带标签融合蛋白。
[0039] 作为一种优选技术方案，所述的脂肪酸结合蛋白FABP优选为人类FABP6。
[0040] 上述的柔性接头优选为6~30个氨基酸，进一步优选为15~20个氨基酸，更进一步 优选的所述柔性接头的序列如SEQ ID N0:15所示;所述组氨酸标签包含5-8个化S，优选6个 化S，更进一步优选的，所述组氨酸标签的序列如SEQ ID N0:13所示。
[0041] 更进一步优选的，所述的可溶性碱性成纤维细胞生长因子融合蛋白的氨基酸序列 如沈Q ID NO: 16所示。
[0042] 上述可溶性碱性成纤维细胞生长因子融合蛋白的编码基因。
[0043] 作为一种优选技术方案，所述可溶性碱性成纤维细胞生长因子融合蛋白的编码基 因的核巧酸序列如SEQ ID NO: 17所示。
[0044] 含有上述编码基因的表达载体、转基因细胞系和表达工程菌。
[0045] -种可溶性碱性成纤维细胞生长因子融合蛋白表达载体，该表达载体是将上述融 合蛋白的编码基因插入到原核细胞表达质粒的NcoIAhoI酶切位点之间得到;优选的:所述 融合蛋白的编码基因的核巧酸序列如SEQ ID N0:17所示；所述的原核细胞表达质粒为 pET28a〇
[0046] -种制备可溶性碱性成纤维细胞生长因子融合蛋白的方法，将上述的表达载体转 化感受态表达菌株获得表达工程菌，并进行培养得到可溶性碱性成纤维细胞生长因子融合 蛋白。
[0047] 上述可溶性碱性成纤维细胞生长因子融合蛋白表达载体在表达可溶性碱性成纤 维细胞生长因子融合蛋白中的应用。
[0048] 本发明可溶性碱性成纤维细胞生长因子融合蛋白表达载体pFABP6-bFGF的详细制 备过程：
[0049] 1)基于多聚酶链式反应(PCR)的全基因人工合成方法，合成了人游离脂肪酸结合 蛋白6巧48口6)与人6尸6尸的融合蛋白尸48口6-6尸6尸(569 10^:16)的0麻编码序列（569 10 N0:17)。
[0化0] 2)将上述FABP6-bFGF编码DNA经过NcoIAhoI DNA内切酶消化，琼脂糖凝胶电泳分 离纯化，得到插入片段。
[0051] 3)经过内切酶Ncol/Xhol双酶切并琼脂糖凝胶电泳分离纯化原核细胞表达质粒 pET28a，但不限于该表达质粒。
[0052] 4)用T4DNA连接酶将载体祀T28a与FABP6-bFGF编码DNA插入片段相连接，转化感受 态菌D册a，获得正确序列的阳性克隆pFABP6-bFGF，即为工程质粒。
[0053] 5)将pFABP6-bFGF质粒转化化2UDE3)感受态表达菌株，卡那霉素存在下筛选与诱 导表达测试，获得表达工程菌株化21 (DE3) /pFABP6-bFGF。
[0054] W上所述的FABP优选人类FABP，本发明采用人类FABP6(SEQ ID N0:8)，但不限于 FABP6,可W是FABPl~FABP9的任何一种或亚种(SEQ ID N0:1~11)。
[0055] 所述的FABP优选置于bFGF上游。在FABP与bFGF之间优选放置柔性接头DNA编码序 列，柔性接头优选编码6~30个氨基酸，进一步优选编码15~20个氨基酸。
[0056] 所述的FABP编码序列上游包含组氨酸标签，所述的组氨酸标签5-8个化S密码子不 等，优选6个。所述的组氨酸编码序列位于起始密码子ATP的下游。
[0057] 本发明所述的pFABP6-bFGF表达载体在表达目标蛋白中具有如下优点：
[005引1)可溶性蛋白与包涵体蛋白的比值大于70 % ;
[0059] 2)容易借助组氨酸标签化is-Tag)亲和纯化获得目标蛋白；
【附图说明】
[0060] 图l、FABP-bFGF融合蛋白示意图
[0061 ] 图2、pFABP6-bFGF表达载体物理图
【具体实施方式】
[0062] 下面通过具体实施例对本发明的应用进行说明，所举的实施例仅是对本发明的应 用作概括性例示，有助于更好地理解本发明的用途，但并不会限制本发明应用范围。下述实 施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法;所述试剂和材料，如无特殊说明，均可 从商业途径获得。
[0063] 实施例1
[0064] -种可溶性表皮生长因子蛋白表达载体的构建方法，包括W下步骤：
[0065] 步骤一、人类FABP与人类bFGF的编码DNA的人工合成和优化，本实施例W人类 FABP6为例(SEQ ID N0:8)，人类bFGFWl55个氨基酸的成熟肤为例(SEQ ID N0:12):
[0066] (1)将His-Tag氨基酸序列（SEQ ID NO: 13)、去除起始甲硫氨酸的FABP6氨基酸序 列（SEQ ID N0:14)、柔性接头氨基酸序列（SEQ ID N0:15)、去除起始甲硫氨酸的bFGF氨基 酸序列（569 10側：12)，按次序合并为巧13-1曰旨一。48?6-柔性接头一6。6口'（569 10顯： 16)，但不限于此序列，W蛋白质氨基酸序列同源性等于或大于85%为限。
[0067] (2)将该编码序列输入NCBI软件DNAworks(v3.2.3):
[0068] ①获得逆翻译的并且密码子优化了的DNA编码序列（SEQ ID NO: 17);
[0069] ②获得用于PCR方法全基因合成的引物(SEQ ID N0:18~41)。
[0070] ③在第一个引物的起始密码5'-端添加NcoI内切酶位点和四个保护碱基(SEQ ID N0:18)。
[0071] ④在最后一个引物的终止密码5'-端添加趾Ol内切酶位点和四个保护碱基（SEQ ID N0:41)。
[0072] (3)多聚酶链式反应(PCR)法合成全长编码DNA序列第一步：
[0073] ①将引物用无菌去离子水分别稀释至IOiiMole浓度；
[0074] ②从每管引物分别取化L加入1支20化L PCR管；
[00巧]③然后依次加入dNTP化L，IOx PCR Buffer化^无菌去离子水加至50化；
[0076] ④最后加入高保真DNA聚合酶0.25化；
[0077] ⑤PCR参数：预变性95°C/3min;变性94°C/30sec，退火58°C/30sec，延伸72°C/ 2min,20个循环;补全延伸72°C/5min。
[0078] (4)多聚酶链式反应(PCR)法合成全长编码DNA序列第二步：
[0079] ①取第一步PCR扩增产物化L加入至Ij200化新的PCR管；
[0080] ②分别加入第一个引物和最后一个引物各
[0081 ] ③然后依次加入dNTP化L，IOx PCR Buffer化^无菌去离子水加至50化；
[0082] ④最后加入高保真DNA聚合酶0.25化；
[0083] ⑤PCR参数：预变性95°C/3min;变性94°C/30sec，退火60°C/30sec，延伸72°C/ 2min,35个循环;补全延伸72°C/5min。
[0084] (5)PCR产物的纯化与酶切
[00化]PCR产物经微型硅胶柱离屯、纯化，Nco IAho I限制性内切酶双酶切过夜。
[00化](6)酶切DNA产物的纯化
[0087]采用0.8%琼脂糖凝胶电泳回收获得两端分别是化O I和趾O I的粘性接头的插入 片段。
[008引步骤二、载体DNA制备：
[0089] 制备表达载体祀T28a，但不限于该表达载体：
[0090] (1)取祀T28a载体化g，用限制性内切酶化O巧日趾O I双酶切。
[0091] (2)琼脂糖凝胶电泳分离、纯化线性化后的祀T28a载体。
[0092] 步骤=、连接与转化
[0093] (1)用T4DNA连接酶将包含FABP6-bFGF序列的插入片段和步骤二制备好的祀T28a 表达载体连接。
[0094] (2)转化大肠杆菌感受态菌株D册a,含卡那霉素化an)抗生素的琼脂培养皿培养过 夜，然后挑取单菌落，常规PCR法鉴定阳性克隆。
[00M] (3)将阳性克隆送交DNA序列分析，选取和保留序列正确的克隆，常规制备DNA质 粒。
[0096] (4)获得的工程载体质粒命名为pFABP6-bFGF(SEQ ID N0:42)
[0097] 实施例2
[0098] 载体的表达测试：
[0099] (1)将得到的pFABP6-bFGF载体DNA质粒转化大肠杆菌表达菌株BL21 (DE3)感受态 细胞，获得卡那霉素化an)抗性的菌落。
[0100] (2)挑取单菌落数个，LB培养基培养，IPTG诱导4-12小时，收集菌液ImL,离屯、收集 菌体，1 X PBS洗涂一次，再悬浮于0.5mL 1 X PBS，超声破碎菌体，离屯、去沉淀。
[0101] (3)取适量20化上清与SDS-PAGE上样缓冲液混合，95 °C加热变性10分钟，离屯、收集 至管底，置于冰上。
[0102] (4)取10化上样，12%聚丙締酷胺电泳，考马斯亮蓝染色、脱色，观察蛋白质条带和 FABP6-bFGF蛋白的表达情况。
[0103] (5)重组FABP6-EGF，包括N-HisTag、柔性接头、多克隆区，共310aa，分子量 33.73kDa JABPe-bFGF占菌体总蛋白的20-25 %，可溶性蛋白占60-70 %，包涵体占30-40 %， 显著优于既往文献记载的bFGF裸露表达的可溶性蛋白占比(现有技术中bFGF裸露表达的可 溶性蛋白仅占0~10%，几乎不值得单独分离可溶性组分，全部按包涵体变性处理，然后体 外复性，工艺步骤复杂）。
【主权项】
1. 一种可溶性碱性成纤维细胞生长因子融合蛋白，其特征在于是如下（1)或(2)的蛋白 质： (1) 由脂肪酸结合蛋白FABP和碱性成纤维细胞生长因子蛋白融合得到的融合蛋白； 所述的脂肪酸结合蛋白FABP是FABPl~FABP9中的任意一种或亚种，所述FABPl~FABP9 的氨基酸序列如下所示： 所述的FABPl为氨基酸序列如SEQ ID NO: 1所示的蛋白质； 所述的FABPl-I为氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示的蛋白质； 所述的FABP1-2为氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示的蛋白质； 所述的FABP2为氨基酸序列如SEQ ID N0:4所示的蛋白质； 所述的FABP3为氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示的蛋白质； 所述的FABP4为氨基酸序列如SEQ ID N0:6所示的蛋白质； 所述的FABP5为氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示的蛋白质； 所述的FABP6为氨基酸序列是SEQ ID NO:8第2~127位氨基酸残基所示的蛋白质； 所述的FABP7为氨基酸序列如SEQ ID N0:9所示的蛋白质； 所述的FABP8为氨基酸序列如SEQ ID NO: 10所示的蛋白质； 所述的FABP9为氨基酸序列如SEQ ID NO: 11所示的蛋白质； 或者，为将SEQ ID NO: 1~11所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/ 或缺失和/或添加且具有相同功能的由其衍生的蛋白质； 所述碱性成纤维细胞生长因子蛋白为氨基酸序列如SEQ ID NO: 12所示的蛋白质，或者 为将SEQ ID NO: 12所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或 添加且具有相同功能的由其衍生的蛋白质； 所述的脂肪酸结合蛋白FABP和碱性成纤维细胞生长因子蛋白通过柔性接头连接； (2) 将(1)的N端连接组氨酸标签得到带标签融合蛋白。2. 根据权利要求1所述的可溶性碱性成纤维细胞生长因子融合蛋白，其特征在于所述 的脂肪酸结合蛋白FABP优选为人类FABP6。3. 根据权利要求1所述的可溶性碱性成纤维细胞生长因子融合蛋白，其特征在于所述 的柔性接头优选为6~30个氨基酸，进一步优选为15~20个氨基酸，更进一步优选的所述柔 性接头的序列如SEQ ID NO: 15所示;所述组氨酸标签包含5-8个His，优选6个His，更进一步 优选的，所述组氨酸标签的序列如SEQ ID NO: 13所示。4. 根据权利要求3所述的可溶性碱性成纤维细胞生长因子融合蛋白，其特征在于该融 合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO: 16所示。5. 权利要求1~4中任意一项所述可溶性碱性成纤维细胞生长因子融合蛋白的编码基 因。6. 根据权利要求5所述可溶性碱性成纤维细胞生长因子融合蛋白的编码基因，其特征 在于该编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO: 17所示。7. 含有权利要求5或6所述编码基因的表达载体、转基因细胞系和表达工程菌。8. -种可溶性碱性成纤维细胞生长因子融合蛋白表达载体，其特征在于该表达载体是 将权利要求1-4中任意一项所述融合蛋白的编码基因插入到原核细胞表达质粒的NcoI/ Xho頂每切位点之间得到;优选的：所述融合蛋白的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID N0:17 所示;所述的原核细胞表达质粒为pET28a。9. 一种制备可溶性碱性成纤维细胞生长因子融合蛋白的方法，其特征在于将权利要求 8所述的表达载体转化感受态表达菌株获得表达工程菌，并进行培养得到可溶性碱性成纤 维细胞生长因子融合蛋白。10. 权利要求8所述可溶性碱性成纤维细胞生长因子融合蛋白表达载体在表达可溶性 碱性成纤维细胞生长因子融合蛋白中的应用。
【文档编号】C12N1/21GK105924532SQ201610403079
【公开日】2016年9月7日
【申请日】2016年6月8日
【发明人】李万波, 陕婧婧, 卢婵
【申请人】盘古基因生物工程(南京)股份有限公司