一种苯并噻唑类衍生物作为硝基还原酶荧光探针及应用的制作方法

本发明涉及苯并噻唑类衍生物的用途，具体为一种苯并噻唑类衍生物作为硝基还原酶荧光探针及应用。

背景技术：

缺氧即供氧量不足，已在临床上被作为肿瘤恶化的一个重要指标。恶性肿瘤在失控性生长和增殖过程中会消耗大量的氧气和营养，致使血管中的血液提供的氧气不足以支持细胞的生长，形成高度缺氧微环境，即为肿瘤乏氧区域。这些缺氧微环境的形成使得肿瘤微血管异常，导致癌症化疗药物难以进入该区域，降低了抗癌药物的疗效，同时也成为肿瘤复发的根源。因此对肿瘤细胞内缺氧程度的评估在癌症的诊疗和相关研究中具有十分重要的意义。

目前已用于缺氧程度检测方法有氧压力测量、血流速度、缺氧标记法等。其中缺氧生物标记法以其操作简便、广泛性、高灵敏性、专一性以及可在细胞水平直接、实时观察而不影响细胞正常生理过程而显示独特的优势。研究表明缺氧环境中随着氧含量下降会导致生物体内硝基还原酶(ntr)的含量和活性增加，尤其在实体肿瘤内，硝基还原酶的含量增加与缺氧程度密切相关。因此，硝基还原酶可作为肿瘤的生物标记物用于评价肿瘤微环境的缺氧程度。

目前文献已报道了多种基于香豆素、萘酰亚胺、荧光素、罗丹明等体系的硝基还原酶荧光探针，然而大部分探针具有识别ntr后量子产率较低和检测灵敏度受限等缺陷。因此，开发新型的硝基还原酶探针用于生物体内缺氧程度检测仍然具有重要意义。

技术实现要素：

针对上述问题本发明提供了一种苯并噻唑类衍生物作为硝基还原酶荧光探针用于检测缺氧程度的应用。

为了达到上述目的，本发明采用了下列技术方案：

一种苯并噻唑类衍生物作为硝基还原酶荧光探针是6-(2-(6-硝基苯并噻唑-2-基)乙烯基)萘-2-酚，结构式为：

一种苯并噻唑类衍生物作为硝基还原酶荧光探针的应用是高灵敏检测癌细胞缺氧程度。

与现有技术相比本发明具有以下优点：(1)在硝基还原酶(ntr)、还原性辅酶(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，nadh)的作用下，苯并噻唑基团上的硝基被还原成氨基，增强了整个分子体系的分子内电荷转移效应，致使荧光显著增强。(2)该探针对硝基还原酶的检测在20min内可达到最大值，具有较短的反应时间。(3)对硝基还原酶的检测具有较高的灵敏性和选择性，不受ph及其他常见生物酶的干扰。(4)该探针具有良好的细胞膜通透性，成功实现癌细胞缺氧程度的高灵敏检测。

附图说明

图1本发明实施例1中探针6-(2-(6-硝基苯并噻唑-2-基)乙烯基)萘-2-酚检测硝基还原酶(ntr)的原理示意图；

图2本发明实施例1中探针6-(2-(6-硝基苯并噻唑-2-基)乙烯基)萘-2-酚检测硝基还原酶浓度的滴定实验；激发波长：405nm；探针浓度：10μm；硝基还原酶浓度分别为0、0.5、1.0、1.5、2.0、3.0、3.5、4.0、5.0、5.5、6.5、7.0、7.5、8.0、9.0、10.0μg/ml；硝基还原辅酶终浓度为300μm。

图3本发明实施例1中探针6-(2-(6-硝基苯并噻唑-2-基)乙烯基)萘-2-酚的荧光强度i534nm随硝基还原酶浓度变化曲线。

图4本发明实施例1中探针6-(2-(6-硝基苯并噻唑-2-基)乙烯基)萘-2-酚检测硝基还原酶的动力学实验。激发波长：405nm；探针浓度：10μm；硝基还原酶浓度分别为10.0μg/ml，测试时间：60min，间隔时间5min；

图5本发明实施例1中探针6-(2-(6-硝基苯并噻唑-2-基)乙烯基)萘-2-酚检测硝基还原酶的选择性实验；激发波长：405nm；探针浓度：10μm；

图6本发明实施例1中探针6-(2-(6-硝基苯并噻唑-2-基)乙烯基)萘-2-酚在人宫颈癌细胞(hela)中激光共聚焦显微成像图；激发波长：405nm；收集发射波段：475-600nm。

具体实施方式

实施例1

将探针6-(2-(6-硝基苯并噻唑-2-基)乙烯基)萘-2-酚用二甲亚砜配制浓度为1mm的储备液；硝基还原酶用ph为7.4的磷酸盐缓冲液配制浓度为1mg/ml的储备液；硝基还原辅酶用ph为7.4的磷酸盐缓冲液配制浓度为1mg/ml的储备液。实验中用ph为7.4的磷酸盐缓冲液配制探针终浓度为10μm，硝基还原酶终浓度分别为0、0.5、1.0、1.5、2.0、3.0、3.5、4.0、5.0、5.5、6.5、7.0、7.5、8.0、9.0、10.0μg/ml，硝基还原辅酶终浓度为300μm，于37℃下充分反应30min后，固定激发波长为405nm，记录探针随硝基还原酶浓度变化的荧光发射光谱变化(图2)。随着硝基还原酶浓度由0升高到10.0μg/ml，534nm处的荧光发射逐渐增强并达到饱和，图3给出了534nm荧光强度i534nm随硝基还原酶浓度变化的工作曲线。

实施例2

用ph为7.4的磷酸盐缓冲液配制实施例1中的探针终浓度为10μm，硝基还原辅酶终浓度为300μm，硝基还原酶终浓度为10.0μg/ml，固定激发波长为405nm，时间间隔5min，测试60min，记录37℃下该体系随时间变化的荧光光谱，建立荧光强度随时间变化的动力学曲线(图4)，反应20min，反应体系荧光强度达到饱和。

实施例3

将实施例1中的探针6-(2-(6-硝基苯并噻唑-2-基)乙烯基)萘-2-酚终浓度保持在10μm，分别考察该探针在常见金属离子、活性小分子及氨基酸存在下，对硝基还原酶的的选择性。如图5所示，在ph7.4时，探针对上述物质几乎没有响应，证明该探针对硝基还原酶具有很高的选择性。图5中物质的顺序和浓度依次为：(1)空白(10μm探针+硝基还原辅酶(nadh)300μm)；(2)50mmnacl；(3)50mmkcl；(4)10mmcacl2；(5)10mmmgcl2；(6)1mmh2o2；(7)1mmvitaminc；(8)1mmtryptophan；(9)1mmarginine；(10)1mmtyrosine；(11)1mmglycine；(12)1mmglucose；(13)1mmcysteine；(14)1mmglutathione；(15)10.0μg/ml硝基还原酶。

实施例4

将密度为2×10⁵个/ml的hela细胞在37℃、5％co2的培养箱中培养，待细胞贴壁后，分成两组培养：一组为常氧条件(氧气含量20％)，另一组为缺氧条件(氧气含量1％)，培养12h后，分别向两种培养条件下的细胞中加入实施例1中的探针6-(2-(6-硝基苯并噻唑-2-基)乙烯基)萘-2-酚(终浓度为10μm)，继续培养30min，然后用磷酸盐缓冲液(ph为7.4)轻轻洗涤3次，除去多余的探针，在激光共聚焦显微镜下观察两种培养条件下的细胞成像(图6)。其中，(a)hela细胞加入本发明探针在常氧条件(氧气含量20％)培养的荧光成像；(b)是(a)的明场成像；(c)分别是(a)和(b)的叠加成像；(d)hela细胞加入本发明探针在缺氧条件(氧气含量1％)培养的荧光成像；(e)是(d)的明场成像；(f)分别是(d)和(e)的叠加成像。固定激发波长为405nm收集黄色发射范围475-600nm。标尺：50μm。在常氧条件(氧气含量20％)条件下的细胞与本发明探针作用后几乎看不到荧光发射，而在缺氧条件(氧气含量1％)条件下的细胞与本发明探针作用后绿色荧光强度明显增强，说明本发明探针具有良好的细胞膜通透性，能够高灵敏实现癌细胞缺氧程度的检测。