专利名称：一株喹啉降解菌及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于环境污染物生物强化技术领域，具体涉及一株喹啉降解菌及其应用。
背景技术：
喹啉及其衍生物是典型的多环芳香含氮杂环化合物，广泛存在于浙青、页岩油及原油中，是染料、油漆、农药等领域重要的原料及溶剂。喹啉是一种毒性大、致畸性和致癌性强的有机物，难于生物降解，具有较高水溶性和潜在流动性，易通过土壤污染地下水资源， 对人类健康和生态环境具有巨大的潜在危害。与物理和化学方法相比，生物处理法具有处理量大，成本较低，条件温和，不产生二次污染等特点，更符合构建环境友好型及资源节约型社会的要求。然而，传统的生物处理技术已难以满足日益严格的环保要求。近年来，生物强化技术在不改变现有处理设施的基础上，通过特定功能微生物的添加，提高原有生物处理系统对目标污染物的去除效能，大大提高了污水处理能力，因而越来越引起人们的重视。目前，国内外已有部分学者筛选出对喹啉具有高效降解性能的菌株，如假单胞菌(Pseudomonas sp.)、皮氏伯克霍尔德氏菌(Burkholderia pickettii)、红球菌 (Rhodococcus sp·)、丛毛单胞菌属(Comamonas sp.)、乳杆菌(Lactobacillus)、白腐真菌(white rot fungi)、莫拉菌属(Moraxella sp. )、口引哚脱硫杆菌(Desulfobacterium indolicum)等，这些研究大多仅停留在实验室阶段。到目前为止，国内外有部分学者研究表明芽孢杆菌(Bacillus sp.)可以降解4，5，6_三氯邻甲氧基苯酚(4，5， 6-trichloroguaiacol)、苯并[a]花(benzo [a]pyrene)禾口口比F (pyridine)，但未见其降角军喹啉的报道。炼油废水、焦化废水和焦油加工废水中含有一定浓度的喹啉，而喹啉属于难生化降解有机物，因此仅靠生物处理装置中的普通微生物很难实现对喹啉的有效降解。
发明内容
本发明旨在解决普通微生物对喹啉降解效率低的问题，目的是提供一株喹啉降解菌，实现其对炼油废水、焦化废水和焦油加工废水生物强化处理。本发明所提供的喹啉降解菌Q2源于中国石油化工股份有限公司武汉分公司厂区内受石化产品污染的土壤。以喹啉作为唯一碳源、氮源和能源进行生长繁殖，在喹啉无机盐培养基中对土壤中的菌群进行驯化培养，并通过平板划线分离纯化得到。其中，喹啉无机盐培养基成分为=Na2HPO4· 12H20 4. 26g, KH2PO4 2. 65g，MgSO4 · 7H20 0. 20g，CaCl2 0. 006g, FeSO4 ·7Η20 0. 02g，2mL微量元素储备液，补足蒸馏水至IOOOmL ；微量元素储备液组分为 MnSO4 · H2O 0. lg, ZnSO4 · 7H200. 12g, H3BO3 0. 07g, Na2MoO4 · H2O 0. 04g, CuSO4 · 5H20 0. 02g, CoCl2 0. 04g，补足蒸馏水至 IOOOmL0该菌为革兰氏阳性菌，经16S rRNA鉴定为芽孢杆菌(Bacillus sp)，编号Q2，其 16S rDNA的GenBank登录号为JN132107，于2011年7月6日保藏于中国典型培养物保藏中心(武汉大学)，保藏编号为CCTCC N0M2011239。生理生化特性鉴定显示该菌为产硫化
3氢试验、V-P试验和硝酸盐还原试验阳性，吲哚试验、甲基红试验和淀粉水解试验阴性。菌落为乳白色，边缘整齐，呈圆形，光滑湿润，中心凸起。较优培养条件温度为30°C，初始pH为7 10，接种量为20 %，摇床转速为 IOOrpm0本发明还涉及所述芽孢杆菌(Bacillus sp)Q2在喹啉降解中的应用，应用于生物降解工业废水中的喹啉，工业废水为炼油废水、焦化废水和焦油加工废水中的一种。与现有技术相比，发明的芽孢杆菌(Bacillus sp)Q2能利用喹啉作为唯一碳源、氮源和能源进行生长繁殖，在30h内将500mg/L的喹啉降解完全。芽孢杆菌(Bacillus sp)Q2 能耐受浓度高达1400mg/L的喹啉，对较高浓度喹啉工业废水具有优良的降解效果，该菌可应用于炼油废水、焦化废水和焦油加工废水的生物强化处理，应用前景广阔。
图1为芽孢杆菌(Bacillus sp)Q2的生长与喹啉降解效果关系图；图2为喹啉初始浓度对芽孢杆菌(Bacillus sp)Q2降解喹啉的影响；图3为培养温度对芽孢杆菌(Bacillus sp)Q2降解喹啉的影响；图4为初始pH值对芽孢杆菌(Bacillus sp) Q2降解喹啉的影响；图5为接种量对芽孢杆菌(Bacillus sp)Q2降解喹啉的影响；图6为摇床转速对芽孢杆菌(Bacillus sp)Q2降解喹啉的影响；图7为芽孢杆菌(Bacillus sp) Q2对添加较高浓度喹啉的炼油废水的强化处理效果；图8为芽孢杆菌(Bacillus sp) Q2对添加较高浓度喹啉的焦化废水的强化处理效果；图9为芽孢杆菌(Bacillus sp) Q2对添加较高浓度喹啉的焦油加工废水的强化处
理效果。
具体实施例方式下面结合附图和具体实施方式
对本发明做进一步描述，并非对其保护范围的限制。实施例1 芽孢杆菌(Bacillus sp)Q2的分离、鉴定及其对喹啉的降解性能1、菌株的分离、纯化(1)菌种来源菌源采自中国石油化工股份有限公司武汉分公司污水处理站内受污染的土壤，呈黑褐色，采集距表层3 6cm的土壤样品4份。(2)菌株的分离纯化将采集的土样加入无菌蒸馏水空曝Mh，静置后取IOmL上清液接种于90mL含 200mg/L喹啉的LB培养基(蛋白胨1 %，氯化钠1 %，酵母抽提物0. 5% )中，在30°C和150r/ min活化培养Mh。取5mL培养液转接至含喹啉200mg/L的喹啉无机盐培养基中，同样条件驯化培养2 3d，然后取5mL培养液移接至新鲜喹啉无机盐培养基，如此反复3次，其中喹啉浓度分别为200、500、1000mg/L ；将含喹啉1000mg/L的驯化液按不同比例稀释，分别涂布于含喹啉500mg/L的喹啉无机盐平板上，30°C培养4d。挑选边缘清晰的菌落，经LB平板划线纯化至获得单菌落，分别进行喹啉降解试验。确定各菌株降解喹啉能力后，以含喹啉500mg/ L的LB斜面保藏降解性能优良的菌株。2、菌株的鉴定(1)喹啉降解菌株Q2的菌落形态特征及生理生化特性喹啉降解菌株Q2菌落为乳白色，边缘整齐，呈圆形，光滑湿润，中心凸起。生理生化特性鉴定显示该菌为产硫化氢试验、V-P试验和硝酸盐还原试验阳性，吲哚试验、甲基红试验和淀粉水解试验阴性。(2)喹啉降解菌株Q2的16S rRNA鉴定对喹啉降解菌株Q2的16S rRNA基因进行克隆、测序，然后在GenBank中进行 Blast比对。结果显示，与其序列相似性达到99%的均为芽孢杆菌属(Bacillus sp)，其 16S rDNA序列如序列表所示。结合菌株的生理生化特性，将其归属于芽孢杆菌属(Bacillus sp)，编号为Q2。3、菌悬液的制备挑取一环细菌接种于LB培养基，30°C、150rpm培养Mh，取5mL培养物接于新鲜LB 培养基，30°C培养7 他(细菌处于对数生长期)，5000rpm、IOmin离心收集菌体，并用喹啉无机盐培养基(PH 8. 0)洗涤2次，重悬于喹啉无机盐培养基，调节细胞密度至OD6tltl = 1， 4°C保存备用。4、对芽孢杆菌(Bacillus sp)Q2的生长与其对喹啉的降解效果的关系将芽孢杆菌(Bacillus sp)Q2接种于含500mg/L喹啉的无机盐培养基中，于30°C， 150r/min摇床培养，连续测定细胞的生长及喹啉的残留浓度如图1所示，测定结果表明芽孢杆菌(Bacillus sp)Q2的生长趋势与对喹啉的降解过程基本同步，该菌能利用喹啉作为唯一碳、氮和能源物质促进自身生长，并对喹啉有良好的降解效果。5、培养条件对芽孢杆菌(Bacillus sp)Q2的生长及其降解喹啉的能力的影响(1)喹啉初始浓度的影响考察不同的喹啉初始浓度(100、200、400、500、600、 800、1000、1400mg/L)对芽孢杆菌(Bacillus sp)Q2降解喹啉的影响，连续测定培养液中喹啉的残留浓度如图2所示，芽孢杆菌(Bacillus sp)Q2可在30h内将500mg/L的喹啉降解完全，随着喹啉初始浓度的提高，降解过程所需的停滞期明显延长，当喹啉浓度达到1400mg/L 时，芽孢杆菌(Bacillus sp)Q2对喹啉的去除变得很慢。结果表明，随着喹啉浓度的升高， 喹啉对芽孢杆菌(Bacillus sp)Q2的降解抑制作用逐渐增强。(2)培养温度的影响考察不同的培养温度(10、20、30、40°C )对芽孢杆菌 (Bacillus sp)Q2降解喹啉的影响，连续测定培养液中喹啉的残留浓度如图3所示，30°C下经过30h培养，约500mg/L喹啉仅残余15. 3mg/L,明显优于其它温度的去除效果。实验结果表明，芽孢杆菌(Bacillus sp)Q2降解喹啉的温度对比为30°C> 40°C> 20°C> 10°C。(3)初始pH的影响考察不同的初始pH值(3、4、5、6、7、8、9、10)对芽孢杆菌 (Bacillus sp)Q2降解喹啉的影响，连续测定培养液中喹啉的残留浓度如图4所示，根据降解过程中喹啉残留浓度的大小确定不同初始PH值下喹啉降解效果PH = 9 pH = 10 > pH = 8 > pH = 7 > pH = 6 > pH = 5 > pH = 4 > pH = 3。(4)接种量的影响考察不同的接种量(2vol %,5vol %UOvol %U5vol2(^01^^25^1%)对芽孢杆菌(Bacillus sp)株Q2降解喹啉的影响，连续测定培养液中喹啉的残留浓度如图5所示，可以看出，接种量越大，喹啉降解速率越快，当接种量为20vOl% 和2vol 5%时，摇瓶中喹啉的去除速率最高，表明当接种量达到20VOl%此时再单纯依靠增加接种量对提高喹啉降解效果的影响并不明显。(5)摇床转速的影响考察不同的摇床转速(50、100、150、200rpm)对芽孢杆菌 (Bacillus sp)Q2降解喹啉的影响，连续测定培养液中喹啉的残留浓度如图6所示，转速为 50r/min的喹啉降解率明显低于转速为100、150和200r/min的降解率。另外，实验结果显示后三者对喹啉降解率的影响并不十分明显，表明在摇床转速为100 150r/min时已能满足芽孢杆菌(Bacillus sp)Q2对溶氧的需求，此时单纯依靠增大转速对提高喹啉降解效果的影响并不显著。实施例2 芽孢杆菌(Bacillus sp. ) Q2对添加较高浓度喹啉的炼油废水的强化处
理在锥形瓶中，将芽孢杆菌(Bacillus sp)Q2投加到中石化武汉分公司的活性污泥中，设置3组实验考察其对喹啉的去除效果。(a) 32mL炼油废水+33mL喹啉无机盐培养基+500mg/L喹啉+30mL活性污泥 +5vol%的芽孢杆菌(Bacillus sp)Q2菌悬液;(b) 32mL炼油废水+33mL喹啉无机盐培养基+500mg/L喹啉+30mL高压灭菌后的活性污泥+5Vol%的芽孢杆菌(Bacillus sp)Q2菌悬液;(c) 32mL炼油废水+38m喹啉无机盐培养基+500mg/L喹啉+30mL活性污泥。于 30°C，150rpm摇床培养。连续测定培养液中喹啉的残留浓度如图7所示，结果表明未投加芽孢杆菌 (Bacillus sp)Q2的活性污泥对废水中的喹啉降解缓慢，投加芽孢杆菌(Bacillus sp)Q2则显著提高了活性污泥对喹啉的降解能力，并在32h内将含约500mg/L喹啉的炼油废水中的喹啉完全去除。实施例3 芽孢杆菌(Bacillus sp)Q2对添加较高浓度喹啉的焦化废水的强化处
理在锥形瓶中，将芽孢杆菌(Bacillus sp)Q2投加到武钢焦化公司生化处理装置的活性污泥中，设置3组实验考察其对喹啉的去除效果。(a) 32mL焦化废水+33mL喹啉无机盐培养基+500mg/L喹啉+30mL活性污泥 +5V01%的Q2菌悬液；(b) 32mL焦化废水+33mL喹啉无机盐培养基+500mg/L喹啉+30mL高压灭菌后的活性污泥+5Vol%的Q2菌悬液；(c) 32mL焦化废水+38mL喹啉无机盐培养基+500mg/L喹啉+30mL活性污泥。于 30°C，150rpm摇床培养。连续测定培养液中喹啉的残留浓度如图8所示，结果表明芽孢杆菌(Bacillus sp) Q2起到了明显的生物强化作用，并在3 内将含约500mg/L喹啉的焦化废水中的喹啉完
全去除。实施例4 芽孢杆菌(Bacillus sp)Q2对添加较高浓度喹啉的焦油加工废水的强化处理
在锥形瓶中，将芽孢杆菌(Bacillus sp)Q2投加到武钢焦化的活性污泥中，设置3 组实验考察其对喹啉的去除效果。(a) 32mL焦油加工废水+33mL喹啉无机盐培养基+500mg/L喹啉+30mL活性污泥 +5V01%的Q2菌悬液；(b) 32mL焦油加工废水+33mL喹啉无机盐培养基+500mg/L喹啉+30mL高压灭菌后的活性污泥+5vol %的Q2菌悬液；(c) 32mL焦油加工废水+38mL喹啉无机盐培养基+500mg/L喹啉+30mL活性污泥。 于30°C，150rpm摇床培养。连续测定培养液中喹啉的残留浓度如图9所示，结果表明芽孢杆菌(Bacillus sp) Q2起到了明显的生物强化作用，并在3 内将含约500mg/L喹啉的焦油加工废水中的喹啉完全去除。本具体实施方式
的芽孢杆菌(Bacillus sp)Q2能利用喹啉作为唯一碳源、氮源和能源进行生长繁殖，在30h内将500mg/L的喹啉降解完全。芽孢杆菌(Bacillus sp.)Q2能耐受浓度高达1400mg/L的喹啉，对较高浓度喹啉工业废水具有优良的降解效果，该菌可应用于炼油废水、焦化废水和焦油加工废水的生物强化处理，应用前景广阔。
权利要求
1.一株喹啉降解菌，经鉴定为芽孢杆菌(Bacillus sp)，编号Q2，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期2011年7月6日，保藏编号为CCTCC NO :M2011239，菌株16S rDNA 的GenBank登录号为JN132107，其特征在于芽孢杆菌(Bacillus sp) Q2为革兰氏阳性菌， 菌落为乳白色，边缘整齐，呈圆形，光滑湿润，中心凸起；该菌为产硫化氢试验、V-P试验和硝酸盐还原试验阳性，吲哚试验、甲基红试验和淀粉水解试验阴性，能利用喹啉作为唯一碳源、氮源和能源进行生长繁殖。
2.如权利要求1所述喹啉降解菌的应用，其特征在于所述芽孢杆菌(Bacillussp)Q2 能以喹啉为唯一碳源和氮源进行生长，用于生物降解工业废水中的喹啉。
3.如权利要求2所述喹啉降解菌的应用，其特征在于所述工业废水为炼油废水、焦化废水和焦油加工废水中的一种。
全文摘要
本发明公开了一株喹啉降解菌及其应用。本发明所提供的一株喹啉降解菌Q2属于芽孢杆菌(Bacillus sp)，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2011年7月6日，保藏编号为CCTCC NOM2011239，菌株16S rDNA的GenBank登录号为JN132107。该菌为革兰氏阳性菌，菌落为乳白色，边缘整齐，呈圆形，光滑湿润，中心凸起。该菌可以利用喹啉作为唯一碳源、氮源和能源进行生长繁殖，在30h内将500mg/L的喹啉降解完全。Q2能耐受浓度高达1400mg/L的喹啉，对较高浓度喹啉工业废水具有优良的降解效果，该菌可应用于炼油废水、或焦化废水、或焦油加工废水的生物强化处理，应用前景广阔。
文档编号C02F3/34GK102399714SQ20111031243
公开日2012年4月4日 申请日期2011年10月14日 优先权日2011年10月14日
发明者刘学东, 刘家海, 姚嫚, 庹保华, 曾凡亮, 颜家保 申请人:中国石油化工股份有限公司, 武汉科技大学