用于纯化蛋白质的方法和试剂与流程

本申请要求2014年6月25日提交的美国临时申请号62,017,153的优先权，所述临时申请特此出于所有目的以引用的方式整体并入。

背景

适用于研究和商业用途的蛋白质，包括酶，如脱氧核糖核酸酶(DNA酶)可使用重组方法来产生或从天然产生其的细胞来纯化。在任一种情况下，此类蛋白质的纯化是产生适合于使用的蛋白质的重要步骤。DNA酶和其他蛋白质通常使用色谱法来纯化，包括涉及使用多于一个色谱柱的方法。然而，本领域中存在对于便利且提供高纯度和高产率的用于纯化酶(如DNA酶)的方法的明确未满足的需要。

发明概述

本公开提供用于从样品纯化蛋白质的方法，所述方法包括将所述样品负载至色谱柱上并且用至少一种具有极高电导率的缓冲液洗涤所述柱。在一些实施方案中，洗涤缓冲液具有约50mS/cm、约60mS/cm、约70mS/cm、约80mS/cm或更高的电导率。在其他实施方案中，在用极高电导率缓冲液洗涤后用洗脱缓冲液从柱洗脱蛋白质。在其他实施方案中，洗脱缓冲液也具有极高电导率。在其他实施方案中，洗脱缓冲液具有约50mS/cm、约60mS/cm、约70mS/cm、约80mS/cm或更高的电导率。

在一些实施方案中，具有极高电导率的洗涤缓冲液包含选自由(NH₄)₂SO₄、Na₂SO₄和CH₃COONa组成的组的盐。在其他实施方案中，洗涤缓冲液包含0.8M(NH₄)₂SO₄。在一些实施方案中，洗脱缓冲液包含选自由NaCl、KCl和NaOAc组成的组的盐。在其他实施方案中，洗脱缓冲液包含1M NaCl。

在一些实施方案中，所述方法包括至少两个洗涤步骤。在其他实施方案中，所述方法包括第一洗涤步骤，其中用具有低电导率的缓冲液洗涤柱。在其他实施方案中，具有低电导率的缓冲液具有约2mS/cm或约1mS/cm的电导率。在此类实施方案中，第二洗涤步骤包括用极高电导率缓冲液洗涤柱。在一些实施方案中，所述方法包括三个洗涤步骤，其包括(i)用具有低电导率的第一缓冲液洗涤柱；(ii)用具有极高电导率的第二缓冲液洗涤柱；以及(iii)用具有低电导率的第三缓冲液洗涤柱。在一些实施方案中，第一洗涤步骤和第三洗涤步骤使用相同的缓冲液。在一些实施方案中，缓冲液中的一种或多种包含CaCl₂。在其他实施方案中，缓冲液包含1mM CaCl₂。

在一些实施方案中，目标蛋白质是任何蛋白质。在其他实施方案中，蛋白质是由细胞产生的任何蛋白质。细胞可天然产生蛋白质，或细胞可进行遗传转变以表达目标蛋白质。因此，在一些实施方案中，从细胞培养物收获样品且负载至柱上。在一些实施方案中，蛋白质是酶，如DNA酶或RNA酶。在具体实施方案中，蛋白质是重组DNA酶。

在一些实施方案中，色谱柱是离子交换柱，如阴离子交换柱或阳离子交换柱。在一些实施方案中，色谱柱是混合模式的色谱柱，例如混合模式的色谱柱是多模式阴离子交换器，如Capto Adhere柱。

在一些实施方案中，负载至色谱柱上的样品具有介于约5.0与约9.0之间或介于约6.0与约8.0之间的pH。在一些实施方案中，负载样品的pH是约7.0。在一些实施方案中，负载样品的pH与样品中蛋白质的pI大致相同。在其他实施方案中，负载样品的pH高于蛋白质的pI。例如，在一些实施方案中，pH介于约5.0与约9.0之间并且目标蛋白质的pI是约2.5至约4.5。在具体实施方案中，蛋白质是DNA酶并且负载样品的pH介于约5.0与约9.0之间。

在一些实施方案中，高电导率洗涤缓冲液、低电导率洗涤缓冲液和/或洗脱缓冲液的pH介于约5.0与约9.0之间。在其他实施方案中，高电导率洗涤缓冲液、低电导率洗涤缓冲液和/或洗脱缓冲液的pH介于约6.0与约8.0之间。在其他实施方案中，高电导率洗涤缓冲液、低电导率洗涤缓冲液和/或洗脱缓冲液的pH是约7.0。

一方面，本公开提供用于从样品纯化蛋白质的方法，所述方法包括在将所述样品负载至色谱柱上之前向所述样品中添加清洁剂。清洁剂可选自由Triton X-100、十二烷基硫酸钠(SDS)、十四烷基硫酸钠、十六烷基硫酸钠、脱氧胆酸钠、聚氧乙烯脱水山梨糖醇单油酸酯和NP40组成的组。在一些实施方案中，清洁剂是Triton X-100，并且样品中清洁剂的最终浓度是约0.1％至约1％或约0.5％。

在一些实施方案中，本文提供的方法还包括使用本领域中已知的方法，如SDS-Page分析来评估蛋白质的纯度。

一方面，本公开提供用于从细胞培养物样品纯化DNA酶的方法，所述方法包括(i)从表达DNA酶的细胞收集收获的细胞培养物流体(HCCF)，(ii)向所述HCCF样品中添加清洁剂，(iii)将所述样品负载至混合模式的色谱柱上，(iv)用包含1mM CaCl₂的第一洗涤缓冲液洗涤所述柱，(v)用包含0.8M(NH₄)₂SO₄和1mM CaCl₂的第二洗涤缓冲液洗涤所述柱，以及(vi)用包含1.0M NaCl和1mM CaCl₂的洗脱缓冲液从所述柱洗脱所述DNA酶。在其他实施方案中，所述方法在步骤(v)与(vi)之间还包括第三洗涤步骤，所述第三洗涤步骤包括用包含1mM CaCl₂的洗涤缓冲液洗涤柱。

在一些实施方案中，本公开提供一种试剂组合或一种试剂盒。在一些实施方案中，试剂组合或试剂盒包括如本文所述的极高电导率洗涤缓冲液。在一些实施方案中，试剂组合或试剂盒包括如本文所述的极高电导率洗涤缓冲液和极高电导率洗脱缓冲液。在其他实施方案中，试剂组合或试剂盒包括具有约80mS/cm或更高电导率的洗涤缓冲液和具有约80mS/cm或更高电导率的洗脱缓冲液。在其他实施方案中，洗涤缓冲液包含约0.8M(NH₄)₂SO₄，并且洗脱缓冲液包含约1M NaCl。在其他实施方案中，洗涤缓冲液和洗脱缓冲液各自包含1mM CaCl₂。

附图简述

图1是示出从HCCF样品纯化DNA酶的色谱图。

图2示出来自DNA酶纯化实验的各种洗脱份的SDS-PAGE分析的结果。泳道1是标记物泳道。泳道2示出未结合的杂质(未与柱结合的杂质)。泳道3示出通过第二次洗涤从柱洗除的结合杂质。泳道4示出洗脱的DNA酶。

发明详述

一方面，本公开提供用于从样品纯化蛋白质的色谱方法。出人意料地，本发明人发现可使用高浓度盐缓冲液经由色谱来纯化蛋白质。在一些实施方案中，本公开提供可通过直接将样品负载至色谱柱上来从样品纯化蛋白质。在其他实施方案中，负载之后使用高浓度盐缓冲液进行洗涤和/或洗脱步骤。因此，在一些实施方案中，本文提供的方法有利地允许在无需显著改变含有蛋白质的样品的特征或组分和/或在最小程度上调整色谱柱的情况下从样品纯化蛋白质。例如，本文提供的方法允许在无需改变负载样品的电导率、pH或其他特征且无需对含有蛋白质的样品进行超滤、渗滤或稀释的情况下从样品纯化蛋白质。

在一些实施方案中，本发明提供通过使用一种或多种具有极高电导率的高浓度盐缓冲液的色谱来纯化蛋白质的方法。在一些实施方案中，所述方法包括至少两个洗涤步骤，一个步骤用于移除未结合的杂质，另一步骤用于移除结合的杂质。在其他实施方案中，所述方法包括第一洗涤步骤，其使用具有低电导率的高盐缓冲液以移除未结合的杂质；第二洗涤步骤，其使用具有极高电导率的高盐缓冲液以移除结合的杂质而不洗脱目标蛋白质；以及洗脱步骤，其使用具有高电导率的高盐缓冲液以从柱洗脱产物。

在一些实施方案中，本公开提供通过色谱纯化蛋白质的方法，所述方法包括将包含所述蛋白质的样品直接负载至色谱柱上，用具有极高电导率的高盐缓冲液洗涤所述柱，并且用具有极高电导率的高盐缓冲液从所述柱洗脱所述蛋白质。因此，在一些实施方案中，本公开提供使用单一色谱步骤来获得高度纯化的蛋白质的方法。

本文提供的方法可用于纯化任何蛋白质，包括在细胞中天然产生的蛋白质以及使用重组方法在细胞中产生的蛋白质。在一些实施方案中，蛋白质是酶。在其他实施方案中，酶是脱氧核糖核酸酶(DNA酶)。在一些实施方案中，本文提供的方法中使用的缓冲液包含CaCl₂，其是DNA酶活性所必需的。在其他实施方案中，酶是核糖核酸酶(RNA酶)。

在一些实施方案中，将含有蛋白质的样品直接负载至高电导率下的柱上。例如，在一些实施方案中，将含有蛋白质的样品负载至电导率超过约8mS/cm、超过约9mS/cm、超过约10mS/cm、超过约11mS/cm、超过约12mS/cm、超过约13mS/cm、超过约14mS/cm、超过约15mS/cm、超过约20mS/cm或超过约25mS/cm的柱上。在一些实施方案中，将含有蛋白质的样品负载至电导率为约6mS/cm至约25mS/cm、或约8mS/cm至约15mS/cm、或约9.5mS/cm至约14.5mS/cm、或约13mS/cm的柱上。在一些实施方案中，蛋白质与柱结合且大量杂质未与柱结合。例如，在一些实施方案中，蛋白质与柱结合且约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％或更多的杂质未与柱结合。

在一些实施方案中，负载蛋白质的pH介于0与14.0之间。在一些实施方案中，负载蛋白质的pH介于约3.0与10.0之间。在一些实施方案中，负载蛋白质的pH介于约4.0与9.0之间。在一些实施方案中，负载蛋白质的pH介于约5.0与8.0之间。在一些实施方案中，负载蛋白质的pH是约7.0。在其他实施方案中，负载蛋白质的pH是约1.0、约2.0、约3.0、约4.0、约5.0、约6.0、约7.0、约8.0、约9.0、约10.0、约11.0、约12.0、约13.0或约14.0。可测试样品的pH并且根据熟练的技术人员熟知的方法来负载。

在一些实施方案中，蛋白质是DNA酶，并且负载样品的pH介于约4.5与14.0之间。在其他实施方案中，蛋白质是DNA酶并且负载样品的pH介于约6.0与8.0之间。在其他实施方案中，蛋白质是DNA酶且负载样品的pH是约7.0。

在一些实施方案中，使用极高电导率的高盐洗涤缓冲液洗涤柱以移除结合的杂质。极高电导率洗涤缓冲液中的盐可选自但不限于(NH₄)₂SO₄、Na₂SO₄和CH₃COONa。在具体实施方案中，极高电导率洗涤缓冲液包含浓度为约0.4M至约1.5M的(NH₄)₂SO₄。在另一实施方案中，极高电导率洗涤缓冲液包含浓度为约0.5M至约1.2M的(NH₄)₂SO₄。在另一实施方案中，极高电导率洗涤缓冲液包含浓度为约0.6M至约1.0M的(NH₄)₂SO₄。在另一实施方案中，极高电导率洗涤缓冲液还包含浓度为约0.8M的(NH₄)₂SO₄。在另一实施方案中，极高电导率洗涤缓冲液还包含浓度为约0.5mM至约1.5mM的CaCl₂。在另一实施方案中，极高电导率洗涤缓冲液还包含浓度为约1mM的CaCl₂。在一些实施方案中，极高电导率洗涤缓冲液包含0.8M(NH₄)₂SO₄、1mM CaCl₂和50mM HEPES。

在一些实施方案中，用极高电导率洗涤缓冲液进行洗涤从柱移除结合的杂质。例如，在一些实施方案中，洗涤移除至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％的结合的杂质。

在一些实施方案中，使用极高电导率的高盐缓冲液(本文中称为洗脱缓冲液)从柱洗脱蛋白质。洗脱缓冲液中的盐可选自但不限于NaCl、KCl和NaOAc。在具体实施方案中，洗脱缓冲液包含浓度为约0.5M至约1.5M的NaCl。在另一实施方案中，洗脱缓冲液包含浓度为约0.7M至约1.3M的NaCl。在另一实施方案中，洗脱缓冲液包含浓度为约0.9M至约1.1M的NaCl。在另一实施方案中，洗脱缓冲液还包含浓度为约1.0M的NaCl。在另一实施方案中，洗脱缓冲液还包含浓度为约0.5mM至约1.5mM的CaCl₂。在另一实施方案中，洗脱缓冲液还包含浓度为约1mM的CaCl₂。在一些实施方案中，洗脱缓冲液包含1.0M NaCl、1mM CaCl₂和50mM HEPES。

在一些实施方案中，洗脱缓冲液洗脱至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％的结合的目标蛋白质。

在一些实施方案中，极高电导率洗涤缓冲液或洗脱缓冲液的pH介于约5.0与9.0之间。在其他实施方案中，极高电导率洗涤缓冲液或洗脱缓冲液的pH介于约6.0与8.0之间。在其他实施方案中，极高电导率洗涤缓冲液或洗脱缓冲液的pH是约7.0。

在一些实施方案中，极高电导率洗涤缓冲液和洗脱缓冲液各自具有超过约70mS/cm、超过约75mS/cm、超过约80mS/cm、超过约85mS/cm、超过约90mS/cm、超过约95mS/cm或超过约100mS/cm的电导率。在一些实施方案中，极高电导率洗涤缓冲液或洗脱缓冲液的电导率介于约25mS/cm与100mS/cm之间、或介于约40mS/cm与100mS/cm之间、或介于约50mS/cm与90mS/cm之间、或介于约70mS/cm与90mS/cm之间。在一些实施方案中，极高电导率洗涤缓冲液或洗脱缓冲液具有约70mS/cm、约75mS/cm、约80mS/cm、约85mS/cm、约90mS/cm、约95mS/cm或约100mS/cm的电导率。

极高电导率洗涤缓冲液或洗脱缓冲液可包含产生由本文例示的盐实现的结果的任何盐。例如且不受限制，极高电导率洗涤缓冲液可包含(NH₄)₂SO₄、Na₂SO₄、CH₃COONa或可产生类似结果的任何盐。在具体实施方案中，极高电导率洗涤缓冲液包含(NH₄)₂SO₄。洗脱缓冲液可包含不限于NaCl、KCl、NaOAc或产生类似结果的任何盐。在具体实施方案中，洗脱缓冲液包含NaCl。在一些实施方案中，极高电导率洗涤缓冲液或洗脱缓冲液包含多于一种盐。本领域的技术人员将认识到，两种缓冲液中(NH₄)₂SO₄和NaCl的浓度或等于(NH₄)₂SO₄或NaCl的盐浓度可在某种程度上改变且仍产生类似结果。

在一些实施方案中，极高电导率洗涤缓冲液与洗脱缓冲液之间的电导率差异是较小的。例如，在一些实施方案中，极高浓度盐缓冲液0.8M(NH₄)₂SO₄用作洗涤缓冲液且极高浓度盐缓冲液1.0M NaCl用作洗脱缓冲液。

在一些实施方案中，本文提供的方法还包括一个或多个另外的洗涤步骤，其中洗涤缓冲液是低电导率缓冲液。例如，在一些实施方案中，所述方法包括第一洗涤步骤，其中第一洗涤缓冲液具有小于约2mS/cm、或小于约1mS/cm、或小于约0.5mS/cm的低电导率。在一些实施方案中，第一洗涤缓冲液具有约0.1mS/cm至约5mS/cm、或约0.5mS/cm至约2mS/cm、或约1mS/cm的电导率。在一些实施方案中，低电导率洗涤缓冲液的pH与负载样品的pH相同。在一些实施方案中，低电导率洗涤缓冲液的pH是约5.0至约9.0、或约6.0至约8.0、或约7.0。在一些实施方案中，低电导率洗涤缓冲液包含CaCl₂。在一些实施方案中，第一洗涤步骤移除任何剩余的未结合杂质。在一些实施方案中，所述方法包括使用低电导率缓冲液的第一洗涤步骤；使用极高电导率、高浓度盐缓冲液的第二洗涤步骤；以及使用低电导率缓冲液的第三洗涤步骤。

在一些实施方案中，所述方法包括以下步骤：在约9.5至约14mS/cm的高电导率和约7.0的pH下直接将样品负载至色谱柱上；用具有约1mS/cm的低电导率和约7.0的pH的洗涤缓冲液洗涤所述柱；用具有约80mS/cm或更大的电导率和约7.0的pH的极高电导率缓冲液洗涤所述柱；用具有约1mS/cm的低电导率和约7.0的pH的洗涤缓冲液洗涤所述柱；以及使用具有约80mS/cm或更大的电导率和约7.0的pH的极高电导率缓冲液从所述柱洗脱所述蛋白质。

在一些实施方案中，本文提供的方法包括在将样品负载于色谱柱上之前向样品中添加清洁剂。清洁剂是本领域中已知的且包括但不限于叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇(Triton X-100)、十二烷基硫酸钠(SDS)、十四烷基硫酸钠、十六烷基硫酸钠、脱氧胆酸钠、聚氧乙烯脱水山梨糖醇单油酸酯以及NP40。在一些实施方案中，清洁剂是Triton X-100。不受理论束缚，向样品中添加清洁剂使来自所述样品的病毒有效失活。本领域的技术人员可根据本文提供的方法容易地确定添加至样品中的清洁剂的适当量。在一些实施方案中，Triton X-100在样品中的最终浓度介于约0.01％与10％之间、或介于约0.05％与5％之间或介于约0.1％与1％之间，或为约0.5％。

除非另外定义，否则本文的所有技术和科学术语均具有本领域的普通技术人员通常所理解的相同含义。尽管与本文所述的那些方法和材料类似或等效的任何方法及材料均可用于实践或测试本发明，但本文中描述优选的方法和材料。

如本文所用，术语“约”是指“约”所修饰的对象的±10％。如本文所用，除非上下文另外明确规定，否则单数形式“一(a/an)”和“所述”包括复数指示物。

如本文所用，术语“低电导率”是指约5mS/cm或更低的电导率；术语“高电导率”是指约5mS/cm至约25mS/cm的电导率；且术语“极高电导率”是指25mS/cm以上，例如至少约50、至少约60、至少约70或至少约80mS/cm的电导率。

本公开提供用于从细胞培养物纯化蛋白质的方法。如本文所用，“细胞系”或“细胞培养物”表示体外生长或维持的细菌、植物、昆虫或高等真核细胞。蛋白质可由细胞天然产生或可经由重组方法产生。重组方法包括通过施用外源性多核苷酸(如重组质粒或载体)使宿主细胞发生遗传转变。重组方法是本领域中熟知的且例如在(Sambrook等人,2001)(Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第3版,Cold Spring Harbor Laboratory Press,2001)和其他实验室教科书中描述。

色谱材料和方法是本领域中已知的且例如在Chromatography:第6版(E.Heftmann,2004)中描述，所述文献以引用的方式整体并入本文。例如，适用于本公开的色谱材料包括但不限于混合模式(例如，Capto Adhere、Capto MMC或羟磷灰石)、离子交换(即，阳离子交换、阴离子交换)、亲和力、疏水相互作用、逆相、尺寸排阻以及吸附材料。本发明还涵盖多种支撑介质，包括琼脂糖、纤维素、二氧化硅和聚(苯乙烯-二乙烯基苯)(PSDVB)。本领域的技术人员还将了解，柱的尺寸(即，直径和长度)将取决于若干种因素，如待负载材料的体积、待纯化蛋白质的浓度和所需的解析度或纯度。

使用本文提供的方法纯化的蛋白质的纯度可通过本领域中已知的任何方法来测量，包括但不限于还原性或非还原性十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)、尺寸排阻色谱、HPLC(高效液相色谱)、毛细管电泳、MALDI(基质辅助激光解吸电离)质谱法或ELISA(酶联免疫吸附测定)。

所引用的所有公布均出于所有目的以引用的方式整体并入本文。本文论述的公布仅在本申请的提交日之前提供其公开内容。本文中的内容都不应解释为承认本发明无权先于先前发明的这种公布。

尽管已结合本发明的具体实施方案对本发明进行了描述，但应了解可进一步修改且本申请意图涵盖一般来说根据本发明的原理对其进行的任何改变、使用或改编，并且包括属于本发明所属领域内的已知或常规实践内且可适用于前文所述的基本特征且如下文在所附权利要求范围内的本公开的这种偏离。

实例1.DNA酶的纯化

在表达DNA酶基因的细胞培养物中表达重组DNA酶。

收获细胞培养物的上清液，且向所收获的细胞培养物流体(HCCF)中添加Triton X-100至0.5％的最终浓度。所得样品具有如说明书中描述的pH和电导率。将这种经Triton X-100处理的样品负载至混合模式的离子交换树脂Capto Adhere上。在这些条件下，DNA酶与树脂结合，且大量杂质不与树脂结合。在负载之后，用在pH 7.0、50mM HEPES中含有1mM CaCl₂的低电导率缓冲液将任何剩余的未结合杂质从柱洗涤。通过用在pH 7.0、50mM HEPES中含有0.8M(NH₄)₂SO₄、1mM CaCl₂的缓冲液洗涤从柱移除结合的杂质。在将这些结合的杂质移除之后，用在pH 7.0、50mM HEPES中含有1mM CaCl₂的低电导率缓冲液洗涤柱且用在pH 7.0、50mM HEPES中含有1M NaCl、1mM CaCl₂的缓冲液洗脱DNA酶。流动速率是100cm/小时。

研究结果在图1和2中示出，其展示从HCCF纯化的DNA酶的极高纯度。图1示出来自实验的色谱图。图2示出每种洗脱份的SDS-PAGE分析。具体地说，图2中的泳道4示出DNA酶在洗脱步骤后的极高纯度。

总而言之，研究结果表明出人意料的一种纯化方法，其中可使用单一色谱柱且将含有DNA酶的样品在高电导率条件下直接负载至柱上，并且随后使用极高电导率洗脱缓冲液进行极高电导率洗涤和洗脱来高度纯化含有DNA酶的样品。在某种程度上，结果是出人意料的，因为关于混合模式树脂的最佳负载条件预期是pH正好低于负载步骤时的蛋白质等电点(pI)的条件。然而，在本文提供的方法中，负载的pH(在本文例示的方法中约7.0)正好高于DNA酶的pI(约4.0至4.5)。