专利名称：高分子-纳米颗粒共轭物及使其稳定的方法、分析系统及治疗剂载体的制作方法
技术领域：
本发明涉及纳米生物技术领域的高分子功能化纳米材料。特别地，本发明涉及寡核苷酸-金纳米颗粒共轭物和寡核苷酸-银纳米颗粒共轭物。
背景技术：
由于米尔金(Mirkin)及其同事开发出的寡核苷酸-纳米颗粒共轭物的示例，这种共轭物已引起了相当大的兴趣；其中米尔金及其同事在1990年代使用寡核苷酸-金纳米颗粒(AuNP)共轭物展示了 DNA比色检测技术。寡核苷酸提供靶序列特异性识别能力，AuNP对与靶标的杂交作出反应、给予溶液颜色变化。由于其典型的表面等离子体共振(SPR)吸收带(吸收峰约为520nm)，分散的寡核苷酸-AuNP共轭物呈红色。一旦与靶标杂交，两组共轭 物的交联导致颗粒团聚(particle aggregation),颗粒间距离的下降引起SPR吸收带的红移，因此溶液颜色变为紫色。替代性地，前田(Maeda)及其同事设计了非交联方法当单组共轭物在适当的盐浓度(即O. 5-2. 5M氯化钠(NaCl))下与完全互补的靶标杂交后，其发生团聚。使用特别设计的序列(例如，DNA酶和适配子)，寡核苷酸-AuNP共轭物用于检测许多非核酸分析物，包含金属离子、小分子、蛋白质和细胞。作为另一示例，寡核苷酸-银纳米颗粒(AgNP)共轭物也用于高灵敏度的比色检测，这是由于其消光系数比AuNP更大。除了诊断以外，已证实这些寡核苷酸-纳米颗粒共轭物、尤其AuNP对治疗(例如基因和化学药物的传递)以及DNA-模板化纳米结构的建立非常有用。制备寡核苷酸-AuNP共轭物和寡核苷酸-AgNP共轭物最常见的方法是将单硫醇修饰的寡核苷酸化学吸附到纳米颗粒的表面。但已知的是，化学吸附的寡核苷酸对热解吸和含硫醇的小分子的置换反应较敏感；所述含硫醇的小分子例如酶促反应缓冲液中经常使用的成分——二硫苏糖醇(DTT)和巯基乙醇。如果没有解决的话，这一稳定性问题将严重限制其应用。例如，当很大一部分的寡核苷酸从AuNP表面解吸时，将发生颗粒团聚，并因此使得溶液颜色甚至在缺少任何靶标的情况下变为紫色。在O. IM DTT中，这在几分钟内发生。为了解决这一问题，米尔金及其同事制备了具有类固醇环状二硫化物(steroid cyclicdisulfide)和硫醇三己酯锚定物(trihexylthiol anchor)的共轭物,其对DTT体现出极为增强的稳定性(分别在2小时和8小时内无团聚)。但是，由于这些寡核苷酸的合成需要非标准的、具有较低偶联收率(coupling yield)的亚磷酰胺,这些寡核苷酸昂贵许多。鉴于此，格拉汉姆(Graham)及其同事报导了合成硫辛酸修饰的寡核苷酸通过标准3’-氨基-修饰C7可控孔度玻璃固体载体和具有硫辛酸的N-羟基琥珀酰亚胺酯的合成；而刘(Liu)及其同事报导了通过氨基修饰的寡核苷酸与二硫化碳之间的反应合成二硫代氨基甲酸盐修饰的寡核苷酸。这两种键合有二硫化物(disulfide-linked)的共轭物在DTT中具有与键合有类固醇环状二硫化物的共轭物相似的稳定性。与硫醇-金(S-Au)键相似的是，硫醇修饰的寡核苷酸可通过硫醇-银(S-Ag)键与AgNP结合、但具有较低的结合亲和力。三环二硫化物和硫辛酸成功地用于增强寡核苷酸-AgNP共轭物的稳定性。
就热解吸而言，S-Au键和S-Ag键是热不稳定的。对单硫醇键合的寡核苷酸-AuNP共轭物而言，寡核苷酸解吸容易在高于70°C的温度发生。这抑制了它们在高温处理中的应用。一个示例即为聚合酶链反应(PCR)，其是使特定DNA序列扩增使用最广泛的方法，且在许多应用中起到重要作用，所述许多应用包含临床诊断、环境监督、食品监管、法医分析、生物战剂检测以及生物学研究。它涉及三个温度下的重复循环，即用于模板/扩增子变性的94°C、用于引物退火的约55°C以及用于引物延伸的72°C。特定序列的数量在每个热循环中加倍，因此单拷贝的模板以百万计(20个循环)至十亿计(30个循环)拷贝的扩增子结束。已报导了采用寡核苷酸-AuNP共轭物对PCR产物进行高灵敏度的比色检测。但是，由于共轭物无法耐受热循环过程，在扩增后期开管添加共轭物是无法避免的，这造成较高风险的携带污染。与PCR期间寡核苷酸解吸相关联的是，Taq DNA聚合酶非特性吸附到暴露的AuNP表面，并因此抑制了扩增反应。鉴于前述稳定性问题、以及本领域中可用溶液的复杂性和高成本，明显需要一种易于实现且低成本的、使寡核苷酸-AuNP共轭物和寡核苷酸-AgNP共轭物稳定的新方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种易于使用、有效且成本低的使寡核苷酸与AuNP或AgNP间的共轭物稳定的方法。作为本发明的另一目标，提供了高度稳定的寡核苷酸-AuNP共轭物和寡核苷酸-AgNP共轭物，其能够在各种苛刻条件下使用(例如苛刻的化学条件和高温)，并对特定应用而言是必需的。根据本发明的一个方面，提供使高分子与纳米颗粒间的共轭物稳定的方法，包括以下步骤(a)将多个高分子化学吸附/吸附到纳米颗粒的表面；以及(b)当高分子已经化学吸附/吸附到纳米颗粒的表面上之后，在颗粒表面包覆(coating)薄的加强层(reinforcement layer)/包封层(entrapment layer)(单层或数层)。对寡核苷酸-AuNP共轭物和寡核苷酸-AgNP共轭物而言，加强层优选为使用(3-巯丙基)三甲氧基硅烷(之后表示为“MPTMS”)形成的二氧化硅层。如果必要的话，可使高分子功能化，以便其能够充分化学吸附/吸附到纳米颗粒表面；例如，对寡核苷酸进行硫醇修饰。在结合此方法所公开的本发明中，寡核苷酸作为高分子而金(Au)和银(Ag)作为纳米颗粒材料表现为用于阐述本发明原理的示例，本领域普通技术人员在实践本发明时可发现其他高分子和纳米颗粒材料。例如，可使用其他生物聚合物(例如，适配子、小干扰RNA(siRNA)和多肽/蛋白质)和合成聚合物(例如，聚乙二醇(PEG))，连同一起可使用其他金属、金属氧化物(例如氧化铁)和半导体的(例如CdSe/ZnS核/壳)纳米颗粒。只要使用的高分子可化学吸附/吸附/键合/依附到使用的纳米颗粒上，并且该依附需要是稳定的，那么本发明的方法是可适用的。示例性的键包含硫醇-Au、氨基-Au、硫醇-Ag、二元醇-氧化铁、氨基-氧化铁、羧基-氧化铁和硫醇-CdSe/ZnS。应该注意的是，本发明适用于不同形状/形式的纳米材料，例如纳米颗粒、核/壳、纳米壳和纳米棒。本发明的中心在于，加强层/包封层以与纳米颗粒表面的高结合亲和力为特征，并且其形成了高分子-纳米颗粒共轭物表面的交联网络。以使用MPTMS形成的二氧化硅层为例，MPTMS分子的巯基基团化学吸附到AuNP/AgNP空缺的表面位点(即没有由高分子占据的位置)，随后三甲氧基硅烷基团水解和缩聚，形成单个或数个二氧化硅单层。这一薄的交联二氧化硅网络包封并加强了化学吸附的寡核苷酸的S-Au/Ag键，从而增强共轭物的化学稳定性和热稳定性。本发明中采用MPTMS形成的二氧化硅层的厚度小于-(CH2)6-(OCH2CH2)6-间隔段的长度，优选小于5nm。事实上，本领域普通技术人员可设想出其他加强型化学品。此处给定两种通用类型的加强前体分子来阐释该概念。第一个与MPTMS前体相似，具有以下结构
权利要求
1.一种使高分子与纳米颗粒间的共轭物稳定的方法，其特征在于，包括以下步骤 Ca)将多个高 分子化学吸附或吸附到纳米颗粒的表面；以及 (b)当所述高分子已经化学吸附或吸附到所述颗粒的所述表面上之后，在所述颗粒的所述表面包覆至少一个加强层。
2.根据权利要求I所述的方法，其特征在于，所述加强层是使用MPTMS形成的二氧化硅。
3.根据权利要求I所述的方法，其特征在于，所述方法还包括步骤(c):在所述步骤(a)之前使所述高分子功能化，以便能够使所述高分子吸附到所述纳米颗粒的所述表面上。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤(c)是对AuNP和AgNP的硫醇修饰。
5.根据权利要求I所述的方法，其特征在于，所述高分子选择自由寡核苷酸、适配子、siRNA、多肽、蛋白质和PEG组成的组。
6.根据权利要求I所述的方法，其特征在于，所述纳米颗粒是金属材料、金属氧化物材料或半导体材料。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述金属纳米颗粒是金纳米颗粒或AuNP。
8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述金属纳米颗粒是银纳米颗粒或AgNP。
9.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述高分子是寡核苷酸。
10.一种高分子-纳米颗粒共轭物，其特征在于，包括 (a)具有外表面的纳米颗粒； (b)覆盖所述纳米颗粒的所述外表面的加强层，以及 (c)多个高分子，所述多个高分子是与所述纳米颗粒的所述表面直接吸附的链的形式，以便所述高分子的链的一部分在所述加强层内。
11.根据权利要求10所述的共轭物，其特征在于，所述高分子是生物分子或聚合物，所述纳米颗粒是金属、金属氧化物或半导体。
12.根据权利要求11所述的共轭物，其特征在于，所述生物分子是寡核苷酸。
13.根据权利要求11所述的共轭物，其特征在于，所述金属是金或银。
14.根据权利要求10所述的共轭物，其特征在于，所述加强层是采用MPTMS形成的二氧化硅。
15.一种分析系统，其特征在于，包括酶和权利要求10的共轭物，所述共轭物用于显示所述酶催化的反应的进展。
16.根据权利要求15所述的分析系统，其特征在于，所述系统还包括DNA引物，其中所述酶是Taq DNA聚合酶，所述共轭物是寡核苷酸_AuNP，以及所述DNA引物具有与所述寡核苷酸-AuNP共轭物互补的序列。
17.根据权利要求15所述的分析系统，其特征在于，所述系统还包括DNA引物，其中所述酶是Taq DNA聚合酶，所述共轭物是寡核苷酸_AgNP，以及所述DNA引物具有与所述寡核苷酸-AgNP共轭物互补的序列。
18.一种治疗剂载体，其特征在于，包括治疗剂和权利要求10的共轭物，所述共轭物用于运载所述治疗剂。
19.根据权利要求18所述的治疗剂载体，其特征在于，所述共轭物是寡核苷酸-AuNP，所述治疗剂与AuNP、或所述寡核苷酸、或与所述寡核苷酸-AuNP互补的序列连接或键合。
20.根据权利要求18所述的治疗剂载体，其特征在于，所述共轭物是寡核苷酸-纳米颗粒，所述纳米颗粒是金属氧化物材料或半导体材料，所述治疗剂与所述寡核苷酸-纳米颗粒连接或键合。
21.根据权利要求I所述的方法，其特征在于，所述加强层是由低聚物形成的交联聚合物。
22.根据权利要求10所述的共轭物，其特征在于，所述加强层是由低聚物形成的交联聚合物。
全文摘要
一种使高分子与纳米颗粒间的共轭物稳定的方法，通过在高分子链已经吸附到纳米颗粒表面后在纳米颗粒表面形成薄的加强层来实现。稳定的共轭物可在大范围的应用中使用，例如体外诊断、体内成像和治疗，这些应用需要在各种苛刻条件或严酷条件下进行。
文档编号B82B3/00GK102887479SQ20121025440
公开日2013年1月23日 申请日期2012年7月20日 优先权日2011年7月20日
发明者李铭鸿, 黄冠锋, 叶社平 申请人:香港理工大学