专利名称：检测卵透明带抗体试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明公开了一种检测卵透明带抗体的试剂盒，特别是一种以猪ZP3的有关组分构建的纯化抗原为主要试剂的检测卵透明带抗体的试剂盒。
研究表明猪的透明带抗原含有3-4个组分，其中ZP3组分与人卵透明带有交叉反应性(Sacco A G et alBiol Reprod，1989，41523)。进一步研究表明猪ZP3组分去糖基后成为ZP3α和ZP3β，分别对应于人卵透明带的ZP1和ZP3。而这两者均作为精子受体组分，尤其是ZP3。猪ZP3β与人ZP3的碱基序列同源性达80％，氨基酸序列同源性达74％；而猪ZP3α与人ZP1的碱基序列同源性达76％，氨基酸序列同源性达66％(Skinner S M et alAm J Repord Immunol，1996，35163)。因此，在得不到人源ZP的情况下，采用猪的ZP3组分作为抗原检测人ZP抗体具有可靠的依据。发明人本人在《暨南大学学报》(自然科学与医学版)，1998，19(suppl)52的文献中公开了一种“不孕妇女血清中卵透明带抗体的检测”方法。从理论实验的角度阐述了以纯化的ZP3抗原来检测卵透明带抗体的可能性和必要性。但因制备、纯化ZP3抗原较困难以及检测步骤繁琐，操作要求高等技术原因，目前国内外尚未有操作方便、商品化的试剂盒，从而严重影响了女性免疫不孕症病因的检查和治疗。在此之后，发明人进行了大量的深入细致的研究工作，为商品化的试剂盒的研究开发作了充分的准备。
本发明的试剂盒包括由板架、板条组成的酶标板，已包被于酶标板的反应孔中的纯化的猪卵透明带ZP3抗原，附配阳性对照血清，阴性对照血清，酶标记物，底物和辅助试剂。
所述试剂盒的试剂组成可以是板条每反应孔包被纯化的猪ZP3抗原5ug；附配试剂为阳性对照血清和阴性对照血清，含HRP-SPA 0.1-1ug/ml的酶标记物试剂，底物即含OPD 0.2-1mg/ml和含H2O20.05-0.1％的显色液试剂，含PBS-Tween 0.2mol/L的工作液。
所述试剂盒的酶标板可以采用硬板，且安装在板架上的板条是可组合拆装的。
所述的显色液(底物)，可以分成两种组分，检测时才混合配制。
所述试剂盒中的试剂可以均加入防腐剂，以便于保存。
本发明的卵透明带抗体试剂盒，应用间接法原理检测血清中的卵透明带抗体，具有特异性强、快速简便等特点，适合于基层医院推广应用。
试剂盒采用的是现在临床广泛采用的灵敏、安全、可靠、易操作的ELISA技术。如
图1～；图3所示，板条2上设置有反应孔3，装配在板架1上，组成了酶标板4。纯化了的猪ZP3抗原5已经包被在反应孔3中。检测时，按下列步骤进行。①将酶标板放置室温平衡10-20分钟，工作液用蒸馏水10倍稀释。②待检血清用工作液1∶20稀释。③将板条固定于板架上，阴性对照、阳性对照、已稀释待检血清各自分别加入三个反应孔3中，每孔加入量均为100μl/孔，另留1孔只加稀释液作为空白对照。④置37℃ 4h，甩净孔中液体，洗板三次，每次甩净拍干，每孔各加酶标记物100μl，置37℃ 40min。⑤甩净孔中液体，同上洗板三次，拍干后各孔滴加显色液100μl/孔，室温放置30分钟后用酶标仪于490nm读数判定结果。
结果判定以空白反应孔调零，490nm波长测定OD值。阳性对照OD值/阴性对照OD值≥0.20，证明实验成立，如S/N≥2.0，则判为阳性(+)，如S/N＜1.5则为阴性(-)，1.5＜S/N＜2.0为可疑(±)。其中S/N＝待检样品OD值/阴性对照OD值。
本发明的试剂盒，采用的底物比其它市面上的通用底物较为稳定，可不必加入终止液，实验结果在30-2h内能保持稳定，便于临床操作，也避免了终止液对实验结果的干扰。同时，试剂盒用阴性对照血清和阳性对照血清作为内参照物，并用阳性对照测定值/阴性对照测定值≥2.0作为监控指标，以监控检测结果的可信度，也便于肉眼观察。
应当注意的是①凡是染菌、溶血、黄疸或高血脂的待检样品可能引起假阳性结果，应重新采血复试。②对检测阳性者建议四周后复查，对抗体水平进行动态观察。
作为本发明的进一步改进，选用高吸附性的硬板代替软板作为酶联免疫反应的载体，使实验结果更稳定，也便于在全自动酶标仪上测定结果。同时，采用在板架上的板条为可拆装组合式的酶标板，在检测时可不必集中一定量的病人一起，而是可以随时做任何数量的病人的检测，使检测结果可当天得出。
更进一步地，本发明的试剂盒的显色液，还可以分成AOPD 0.2-1mg/ml和BH2O20.05-0.1％两种组分，临用前将A、B显色液按1∶1比例混合配制，以保证试剂的稳定性。
本发明的试剂盒中所有的试剂还可以均加入了防腐剂，以便于存放。
由于现在市面上没有商品化的试剂盒供应，临床上至今无法开展透明带抗体(引起女性不孕或早期流产的原因之一)的检测，一些实验室因研究所需，要进行该项检测，必需自行从人或猪卵巢取出完整透明带或提取猪卵透明带抗原组分进行，费时费力，且不同实验室因抗原来源不同、实验方法不同而使结果难以比较。本发明的试剂盒的商品化，将使所有开设不孕症门诊的医院、有关研究机构等都能简单地开展这种检测，大大促进免疫不孕症的诊断和研究、治疗。
权利要求
1.一种检测卵透明带抗体试剂盒，其特征是所述的试剂盒包括由板架(1)、装配在板架(1)中并设有反应孔(3)的板条(2)组成的酶标板(4)，已经包被于酶标板(4)的反应孔(3)中的纯化的猪ZP3抗原(5)，附配阳性对照血清、阴性对照血清、酶标记物、底物和辅助试剂。
2.按权利要求1所述的检测卵透明带抗体试剂盒，其特征是所述的板条(2)在板架(1)中是可拆装组合的。
3.按权利要求1所述的检测卵透明带抗体试剂盒，其特征是所述的试剂盒的试剂组成为板条(2)的每反应孔(3)包被纯化的猪ZP3抗原(5)5ug；附配试剂为阳性对照血清和阴性对照血清，含HRP-SPA 0.1-1ug/ml的酶标记物试剂，底物即含OPD 0.2-1mg/ml和含H2O20.05-0.1％的显色液试剂，含PBS-Tween 0.2mol/L的工作液。
4.按权利要求3所述的检测卵透明带抗体试剂盒，其特征是所述的显色液底物，分成AOPD 0.2-1mg/ml和BH2O20.05-0.1％两种组分，检测时才按A∶B＝1∶1的比例混合配制。
5.按权利要求1、2、3或4所述的检测卵透明带抗体的试剂盒，其特征是所述的试剂盒的试剂中均加入了防腐剂。
全文摘要
本发明公开了一种检测卵透明带抗体试剂盒,包括由板架1、带反应孔3的板条2组成的酶标板4,已包被于酶标板中的纯化的猪ZP3抗原5,附配的阳性对照血清、阴性对照血清、酶标记物、底物和辅助试剂。本发明的检测卵透明带抗体试剂盒,应用间接法原理检测血清中的卵透明带抗体,具有特异性强、快速简便等特点,适合于基层医院及研究机构进行检测的推广应用。
文档编号G01N33/53GK1423129SQ0113003
公开日2003年6月11日 申请日期2001年12月7日 优先权日2001年12月7日
发明者谢琪璇 申请人:暨南大学