专利名称：纳米微球放大技术压电dna生物传感器检测超痕量dna的方法
技术领域：
本发明涉及一种纳米微球放大技术压电DNA生物传感器检测超痕量DNA的方法。
近年来，应用质量型石英晶体微天平(QCM)作为生物传感器发展迅速，在核酸分子杂交识别和测定方面已经显示出了巨大潜力，具有广阔的应用前景。虽然QCM是一种灵敏的质量检测器，可测得亚纳克级质量变化，但在实际检测中，DNA的浓度远远低于QCM直接检测的范围，特别是作为检测超痕量变化的生物传感器，其灵敏度还不能达到要求。
本发明提供的技术方案是一种纳米微球放大技术压电DNA生物传感器检测超痕量DNA的方法，在石英晶片上镀一薄层金膜或银膜，然后让石英晶振选择性的吸附DNA，通过DNA分子杂交，结合成双链DNA(ds-DNA)，将标记有能与双链DNA选择性作用药物或生物试剂的纳米微球，对靶向双链DNA分子形成进行确证和作质量放大，检测超痕量的目标DNA。
上述纳米微球为磁性微球或白蛋白微球。
上述能与DNA双链选择的化学药物为阿霉素类药物。
上述能与DNA双链选择作用的生物试剂为放线菌素D。
上述石英晶振使用前先浸入到无水甲醇溶液10～60分钟，然后超声清洗1～3分钟，再用重蒸水洗涤3～5次，晾干。
本发明通过标记了能与双链DNA选择性作用药物或生物试剂的大质量纳米微球作为放大标记物嵌入与目标DNA杂交后形成的ds-DNA晶片电极上，对靶向双链DNA分子形成进行确证和作质量放大，检测超痕量的目标DNA。与常规的压电DNA生物传感器相比，可使最低检测限改善2～5个数量级，因而不仅可检测超痕量的目标DNA，且选择性强、灵敏度高。
一、放线菌素D修饰的纳米磁性微球的制备配制1.0×10-6mol/L放菌线素D(ActD)的丙酮溶液用于准备氨基-醛基间的交联反应，待加入0.02g醛基磁性微球(可用市售产品)后，将此混合物置于4℃下搅拌、反应4小时，微球在磁力架上用丙酮清洗3次，加入0.5mL的丙酮，4℃保存备用。
二、自组装α-硫辛酸单层膜石英晶片使用前先浸入到无水甲醇溶液30分钟，然后超声清洗1分钟，再用重蒸水洗涤3次，空气中晾干。将洗涤干净的石英晶片迅速置于QCM的Teflon反应小池，加入0.5毫升0.3mol/Lα-硫辛酸的乙醇溶液，2小时后用重蒸水洗涤，空气中晾干。
三、探针的固化从QCM的Teflon反应小池中取出晶片电极，滴加10微升100mg/mL的盐酸1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)和10微升100mg/Ml的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)至自组装单层膜修饰的石英电极片表面，放置20分钟。重蒸水洗涤，于空气中晾干。在晶片金电极表面上加入10微升5′端带有-NH2的ssDNA(5′-XATGGGTATTCAACATTTCCG，X＝-NH2)探针溶液(10-5mol/L)，反应30分钟。用1/15mol/L磷酸缓冲溶液(PBS，pH＝7.0)洗涤，于空气中晾干备用。
四、杂交和嵌合将经过上述处理后的晶片电极装入到QCM的Teflon反应小池中，用0.2mol/L磷酸缓冲溶液(pH＝7.0，含50％甲酰胺)作为杂交缓冲溶液，加入到QCM的Teflon反应小池中，待晶片频率稳定后(Δf≤±1Hz/min)，加入10微升不互补目标DNA(ncDNA)(5′-GACGTCAGCA)，启动QCM，记录频率变化作为空白对照，约5分钟后加入10微升其互补目标DNA(cDNA)(5′-CGGAAATGTTGAATACC)。频率变化稳定后，再向Teflon反应小池中加入5-20微升Act D或经步骤一制备的0.5mg/mL Act D修饰过的纳米微球，使之与ds-DNA嵌合15分钟，记录频率变化。
实施例2以阿霉素修饰的纳米磁性微球对靶向双链DNA分子形成进行确证和作质量放大，检测超痕量的目标DNA。
阿霉素修饰的磁性微球的制备配制2.0×10-6mol/L阿霉素(ADM)的水溶液用于准备氨基-醛基间的交联反应，待加入0.02g醛基磁性微球后，将此混合物置于4℃下搅拌、反应4小时，微球在磁力架上用重蒸馏水清洗3次，加入0.5mL的重蒸水，4℃保存备用。其余步骤同实施例1。
其结果表明，与常规的压电DNA生物传感器相比，本发明极大地提高了QCM的灵敏度(参见附图
，图中横坐标为时间Time/Sec，纵坐标为频率变化Frequancy change/Hz，曲线1为加入ncDNA后频率随时间的变化，曲线2为加入cDNA后频率随时间的变化，曲线3为加入ADM后频率随时间的变化，曲线4为加入ADM修饰的纳米微球后频率随时间的变化)，使最低检测限下降至10-12～10-13mol/L。
实施例3以米托蒽醌修饰的白蛋白纳米微球对靶向双链DNA分子形成进行确证和作质量放大，检测超痕量的目标DNA。
米托蒽醌修饰的白蛋白纳米微球的制备配制2.0×10-6mol/L米托蒽醌的水溶液用于准备氨基-醛基间的交联反应，待加入0.02g醛基白蛋白微球后，将此混合物置于4℃下搅拌、反应4小时，12000转/分钟离心，用重蒸馏水清洗3次，加入0.5mL的重蒸水，4℃保存备用。其余步骤同实施例1。
本发明也可用阿霉素表柔比星、佐柔比星等阿霉素类药物及比生群等其它蒽环类抗肿瘤药物或其它能与双链DNA选择性作用的药物或生物试剂标记的纳米微球作为放大标记物。
权利要求
1.一种纳米微球放大压电DNA生物传感器检测超痕量DNA的方法，在石英晶片上镀一薄层金膜或银膜，然后让石英晶振选择性的吸附DNA，通过DNA分子杂交，结合成双链DNA，其特征是将标记有能与双链DNA选择性作用药物或生物试剂的纳米微球，对靶向双链DNA分子形成进行确证和作质量放大，检测超痕量的目标DNA。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征是所述纳米微球为磁性微球或白蛋白微球。3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征是上述能与DNA双链选择作用的化学药物为阿霉素类药物。
4.根据权利要求1或2所述的方法，其特征是上述能与DNA双链选择作用的生物试剂为放线菌素D。
5.根据权利要求1或2所述的方法，其特征是石英晶振使用前先浸入到无水甲醇溶液10～60分钟，然后超声清洗1～3分钟，再用重蒸水洗涤3～5次，晾干。
全文摘要
一种纳米微球放大技术压电DNA生物传感器检测超痕量DNA的方法,在石英晶片上镀一薄层金膜或银膜,然后让石英晶振选择性的吸附DNA,通过DNA分子杂交,结合成双链DNA,将标记有能与双链DNA选择性作用药物或生物试剂的纳米微球,对靶向双链DNA分子形成进行确证和作质量放大,检测超痕量的目标DNA。本发明通过标记了能与双链DNA选择性作用药物的纳米微球,对靶向双链DNA分子形成进行确证和作质量放大,检测超痕量的目标DNA。与常规的压电DNA生物传感器相比,可使最低检测限改善2～5个数量级,因而不仅可检测超痕量的目标DNA,且选择性强、灵敏度高。
文档编号G01N27/327GK1375696SQ0211577
公开日2002年10月23日 申请日期2002年4月28日 优先权日2002年4月28日
发明者张盛龙, 丁虹, 胡先明, 王海涛, 罗顺德 申请人:武汉大学