专利名称：β－二酮－三价铕配合物纳米荧光探针及其制备和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及纳米稀土荧光探针，具体地说是一种β-二酮-三价铕配合物纳米(稀土)荧光探针及其制备和应用。
背景技术：
医学及生命科学的飞速发展对分析化学提出了大量新的课题，核酸、多肽、蛋白质等生物大分子、生物药物、微生物、超微量生物活性物质等的分析测定对医学及生命科学的发展正起着越来越重要的作用，因此生物分析化学已成为当今国际分析科学领域最重要的前沿研究领域之一；基于上述形势所需，许多新的分析方法和技术不断被开发出来，如纳米荧光探针技术、生物芯片技术、纳米通道技术、分子印迹技术、分子信标技术等，其中纳米荧光探针技术是一个具有广泛应用价值和超高灵敏度的生物分析检测技术。
分子光谱分析方法是医学和生命科学中应用最多的方法，由于荧光分析方法的灵敏度高、选择性好、所需样品量少，因而基于荧光测定的生物分析方法已广泛地应用于各种医学和生命科学的分析检测中。荧光分析法常用来测定生物样品中某些成份的含量，由于生物体系的高度复杂性，为了能获得更多的有价值的信息，对于所使用的荧光探针有很高的要求，如较好的光稳定性，不易被光漂白或光解，探针本身非常稳定，发光持续不闪烁，对被分析的生物成份的活性影响小，具备良好的荧光量子效率，光谱特征突出，最好是类线性光谱，且最大激发峰对最大发射峰的干扰要较小等。
纳米荧光探针是指可标记到生物分子上作为荧光检测探针使用的纳米发光粒子，目前已经开发出来的纳米荧光探针主要有下述几种(1)金纳米粒子(胶体金)探针(文献1W.P.Faulk，Immunochem.，1971，8，1081-1083)金纳米粒子探针的研究始于20世纪60年代，1971年，Faulk和Taylor首次报道了免疫金染色法；当吸附在胶体金表面的抗原或抗体遇到组织或细胞中相应的抗体或抗原时，就会发生特异的结合反应，由于金纳米粒子具有较高的电子密度，因此在电镜下清晰可辨；但要获得较高的灵敏度，就需要较高的探针浓度，且需要较大直径的金粒子，因此往往导致标记物不稳定，长期储存易发生自动凝集。针对上述问题，后来又开发了银染色法，其原理是将含银离子的显影液加入到发生完反应的金纳米粒子中，由于金粒子大量的电荷吸引，使银离子吸附于金粒子周围，然后被还原成单质银，结果呈现金属银的蓝灰色，信号被进一步放大，其灵敏度往往可以达到pg/ml水平。此外还有利用HAuCl4和NH2OH·HCl使标记的金粒子进一步增大，从而增强检测信号的方法，该法用于人免疫球蛋白(IgG)的检测灵敏度较银染色法还高，甚至可与荧光免疫、放射免疫及化学发光免疫法相比(文献2Z.Ma，S.Sui，Angew.Chem.Int.Ed.，2002，41，2176-2179)。
(2)半导体纳米晶(又称量子点)(文献3W.C.W.Chan，S.Nie，Science，1998，281，2016-2018；文献4Y.W.Cao，Angew.Chem.Int.Ed.，1999，38，3692-3694)量子点的发明开创了纳米发光微粒作为标记物应用的新领域；目前文献报道的量子点主要是II-VI族和III-V族元素的化合物，如CdSe，InP和InAs等；量子点激发光范围宽，发射峰尖锐，Stokes位移大，个别量子点的量子产率，如CdSe/CdS纳米晶甚至可以达到100％，在激发光的激发下，量子点发光的颜色随其尺寸的大小而改变，几乎可以获得从蓝色到红色所有波长的发光；将表面修饰后的量子点与生物分子相结合，可用来作为激光扫描成像及免疫分析的荧光探针；量子点荧光探针的缺点是发光不稳定，易闪烁，且不具备足够好的单分散性。
(3)内含荧光分子的纳米荧光探针其中一类是高分子塑料纳米荧光探针(文献5H.Hrm，T.Soukka，T.Lvgren，Clin.Chem.，2001，47，561-568；文献6赵艺强，高海峰，杨武利，府寿宽，荧光标记的高分子微粒及其制备方法，中国专利，
公开日2001年1月3日，公开号CN1278534A)，它是用聚苯乙烯内包β-二酮-铕荧光配合物的纳米塑料荧光微粒，该类高分子塑料微粒在水中易凝集，而在有机溶剂中高分子又易溶胀而导致微粒内荧光分子泄漏；还有一种是以聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸酯类为微粒主体，表面键合或吸附荧光素(如异硫氰酸荧光素)、若丹明(如若丹明6G)、青色素(Cy染料)等荧光物质的纳米荧光微粒。由于这些微粒表面键合或吸附的是常规荧光物质，除了高分子塑料微粒存在的缺点外，还存在荧光测定时各种散乱光和背景荧光干扰测定的问题。
另一类是内包三(联二吡啶)钌荧光配合物的纳米硅胶微粒(文献7S.Santra，P.Zhang，K.Wang，R.Tapec，W.Tan，Anal.Chem.，2001，73，4988-4993；文献8S.Santra，K.Wang，R.Tapec，W.Tan，Journal of BiomedicalOptics，2001，6，160-166；文献9谭蔚泓，王柯敏，肖丹，核壳型纳米颗粒，中国专利，
公开日2002年4月3日，公开号CN1342515A)，该法以三(联二吡啶)钌荧光配合物为核，硅胶为外壳制备了大小均匀的纳米荧光微粒；与传统方法相比较，该法制得的纳米微粒的耐氧化、耐光稳定性都有显著提高，应用于识别人外周血中SmIgG+B淋巴细胞的测定结果与用异硫氰酸荧光素标记抗体方法的检测值相近。由于此类纳米荧光微粒的发光内核-三(联二吡啶)钌荧光配合物所发出的仍然是常规荧光，无法解决各种散乱光和短寿命荧光对荧光测定干扰的问题。
还有一类是申请人最近开发的一种功能性纳米稀土荧光微粒及其制备和应用(文献10袁景利，谭明乾，叶志强，王桂兰，中国专利申请号02144517.6)。时间分辨荧光生物检测技术的最大优点就是可完全消除各种散乱光和短寿命荧光对测定的影响，从而极大地提高测定灵敏度；此类纳米稀土荧光探针具有稀土荧光的优点①荧光寿命极长，有机荧光化合物的荧光寿命通常在10纳秒以内，而纳米稀土荧光探针的荧光寿命在数百微秒以上；②Stokes位移大，纳米稀土荧光探针的最大激发光波长通常在310-370nm的紫外区，而最大荧光发光波长在500nm以上，比普通荧光染料荧光的Stokes位移可大至10倍；③荧光发光的能量非常集中，荧光发光峰的半峰宽在15nm以下；④较高的光稳定性，不易被光漂白或光解。由于此类纳米稀土荧光探针是采用硅胶包裹的方法将一些稀土荧光配合物包在硅胶纳米微粒中制备而成的，在表面修饰及标记生物分子的过程中，可能会由于硅胶外壳的修饰等原因导致所包裹的稀土荧光配合物泄漏，使其荧光减弱，进而降低了测定灵敏度。为解决这种问题，研制一种化学性质更稳定，荧光发光更强，结合更为牢固的纳米稀土荧光探针十分必要。
发明内容
针对以上的问题，本发明的目的是提供一种稳定的、发光强度高的β-二酮-三价铕配合物纳米荧光探针(Nanoparticle LanthanideFluorescence Probe，简称NP)及其制备和应用。
为了实现上述目的，本发明采用的技术方案为由可与硅酸酯共聚合的单体(多为含有三烷氧基硅基团的化合物)与三价铕-β-二酮类荧光配合物于有机溶剂中发生共价键合反应，然后其再与硅酸酯发生共聚，形成的功能性纳米稀土荧光微粒；所述三价铕离子、β-二酮有机配位体、可与硅酸酯共聚合的单体及硅酸酯，它们之间的摩尔比例为1∶2～3(三价铕离子与四齿β-二酮和二齿β-二酮有机配位体的摩尔比分别为1∶2和1∶3)∶10～100∶350～450。
所述可与硅酸酯共聚合的单体较佳的为3-氨基丙基三烷氧基硅或3-巯基丙基三烷氧基硅等，所述硅酸酯的分子式为Si(OR)4，其中的R是-CnH2n+1，n＝1～5；所述β-二酮有机配位体较好的为二齿β-二酮类化合物或四齿β-二酮类化合物；二齿β-二酮类化合物，结构式可表示如下 式中R1＝C6F5或脂肪烃类取代基CnH2n+1，CnF2n+1，其中n＝1、2、3、4或5；R2为芳香烃类取代基 中之一；R3为氯磺酰基(-SO2Cl)、异硫睛基(-NCS)、氨基(-NH2)或肼磺酰基(-SO2NHNH2)；四齿β-二酮类化合物，结构式可表示如下
式中R4为氯磺酰基(-SO2Cl)、异硫睛基(-NCS)、氨基(-NH2)或肼磺酰基(-SO2NHNH2)；R5＝C6F5或脂肪烃类取代基CnH2n+1，CnF2n+1，其中n＝1、2、3、4或5。
β-二酮-三价铕配合物纳米荧光探针具体制备过程为1)荧光前躯体在室温条件下，于有机溶剂中，β-二酮有机配位体和可与正硅酸乙酯共聚合的单体发生共价结合反应，它们的用量摩尔比为1∶5～1∶50，体系中β-二酮有机配位体的摩尔浓度为0.05～0.9μmol/ml，然后加入β-二酮有机配位体摩尔量二分之一的Eu3+，制成荧光前躯体；2)配制微乳液将有机溶剂、助表面活性剂、表面活性剂和水按摩尔比为15～25∶2～7∶1∶6～10均匀混合后制成微乳液；3)在微乳液中加入荧光前躯体，室温条件下搅拌1小时后，加入硅酸酯，最后用3-25％的氨水(NH3占水相的重量百分比)引发聚合，搅拌下室温反应4～48小时，离心分离即可。
总之，本发明以三价铕与β-二酮类配位体所形成的强荧光性配合物为发光物质，纳米稀土荧光探针微粒采用化学共价键键合的方法将稀土荧光配合物牢固地固定在硅胶的网络体系中，通过反相乳液共聚合成粒技术制备而成，并且纳米微粒表面同时引入可与生物分子共价键结合的活性官能团。
所述β-二酮有机配位体和可与正硅酸乙酯共聚合的单体的用量摩尔比为1∶7～1∶18；所述有机溶剂为苯、正己烷、环己烷或石油醚；助表面活性剂为乙醇、丙醇、异丙醇、正己醇、乙二醇、正辛醇或正癸醇；表面活性剂为聚氧乙烯基辛基苯基醚(Triton X-100系列)或聚氧乙烯基壬基苯基醚(NP-5系列)；有机溶剂、助表面活性剂和表面活性剂按摩尔比为摩尔比为20～25∶3～7∶1。
β-二酮-三价铕配合物纳米荧光探针可在时间分辨荧光测定法中应用。所述的时间分辨荧光测定法为时间分辨荧光免疫测定法，时间分辨荧光DNA杂交测定法，时间分辨荧光显微镜成象测定法，时间分辨荧光细胞测定法及时间分辨荧光生物芯片测定法。
本发明的纳米稀土荧光探针除了可以显著增强荧光探针的光稳定性，解决荧光漂白问题，避免标记物大量使用时的“浓度消光”现象等优点以外，还具有如下优点(1)稳定性好。本发明采用共价键合方法将稀土荧光配合物牢牢地固定在纳米微球内，因此获得的纳米稀土荧光探针具有十分稳定的结构，解决了采用硅胶包裹的方法制备的纳米硅胶荧光微球易发生荧光分子泄漏，而造成纳米探针荧光强度减弱的问题。
(2)发光强度高。完全解决了β-二酮类配位体由于难溶于水相，而导致用硅胶包裹技术制备的纳米探针荧光强度较弱的问题。由于纳米硅胶荧光微粒是在油包水的反相乳液中制备而成的，这种方法对于那些具有较多羧基或冠醚结构等亲水性基团的稀土配合物来说，由于稀土荧光配合物主要集中在水相中，从而容易制备出含有较高浓度荧光配合物的纳米荧光微粒，即易制备出荧光强度较大的纳米探针，但β-二酮类配位体与铕的配合物由于难溶于水相，用油包水的反相乳液聚合方法制备的纳米探针荧光强度往往较弱，而先将β-二酮类配位体与铕的配合物共价键合到三烷氧基氨丙基硅烷等单体上，再与硅胶进行共聚，则可以使所得到的单个纳米探针上固定有大量的β-二酮-铕配合物，极大地提高了纳米稀土荧光探针的发光强度。
(3)制备方法简单。在制备纳米硅胶荧光微粒的同时(在结合体中可与正硅酸乙酯共聚的单体相对于稀土荧光配合物是过量的)，一次性地导入了氨基等可与生物分子共价键合的活性官能团，可以直接用于生物分子的标记，省却了繁琐的纳米硅胶微粒用于生物标记前的表面修饰过程。虽然硅胶纳米探针表面有硅羟基，但对硅羟基的表面修饰技术往往要采用剧毒的溴化氰(CNBr)，由于要求条件苛刻，对操作人员会产生极大地不便，甚至会造成身体危害；而采用在硅羟基上引入氨基(将硅胶微球继续与三烷氧基氨丙基硅烷等反应)等方法，一是操作复杂，二是可能使硅胶微粒间发生相互交联，影响纳米探针的分散性，而本项发明则很好地解决了这一问题，制备的纳米微粒探针不但表面具有可用于标记的活性基团，而且大小均匀，分散性良好。
(4)应用范围广。本发明标记后的生物分子可用于各种时间分辨荧光生物检测技术，如时间分辨荧光免疫测定、DNA杂交测定、细胞识别、显微镜成像测定、单细胞原位测定、生物芯片等，适用于生命科学、医学等领域中。
图1为共价键合铕配合物BHHCT-Eu3+的纳米荧光微粒的透射电子显微镜照片。
图2为共价键合铕配合物BHHCT-Eu3+的纳米荧光微粒的常规荧光光谱和时间分辨荧光光谱；(其中-------常规荧光光谱，—时间分辨荧光光谱)。
图3A为共价键合铕配合物BHHCT-Eu3+的纳米荧光微粒(NP)的耐光漂白实验结果图。
图3B为自由BHHCT-Eu3+配合物的耐光漂白实验结果图。
图4为用共价键合铕配合物BHHCT-Eu3+制备的纳米微粒与用硅胶包裹BHHCT-Eu3+和BHHT-Eu3+方法制备的纳米微粒的荧光测定灵敏度比较图；(其中◆为共价键合铕配合物制备的纳米微粒，为用硅胶包裹制备的纳米微粒，▲为BHHT-Eu3+方法制备的纳米微粒)。
图5为用共价键合铕配合物BHHCT-Eu3+的纳米荧光微粒标记蛋白质的反应原理图。
图6为共价键合铕配合物BHHCT-Eu3+的纳米荧光微粒标记链亲合素(SA)用于测定乙型肝炎表面抗原(简称HBsAg)的测定原理图。
图7为用共价键合铕配合物BHHCT-Eu3+的纳米荧光微粒标记链亲合素测定人血清中乙型肝炎表面抗原(HBsAg)的工作曲线。
具体实施例方式
下面通过实施例对本发明作进一步说明。
实施例1共价键合4，4’-二(1”，1”，1”，2”，2”，3”，3”-七氟-4”，6”-己二酮-6”-基)氯磺酰基-邻二苯基苯(简称BHHCT)-铕配合物的纳米荧光微粒的制备及表征(1)共价键合BHHCT-Eu3+配合物的纳米荧光微粒的制备环己烷中加入BHHCT(合成方法参见文献11J.Yuan，K.Matsumoto，H.Kimura，Anal.Chem.，1998，70，596-601)和氨丙基三乙氧基硅(简称APS)，BHHCT与APS的摩尔比1∶5～1∶50，优选1∶7～1∶18，体系中BHHCT的摩尔浓度为0.05～0.9μmol/ml，室温下搅拌反应2小时，然后加入BHHCT摩尔量二分之一的三氯化铕(EuCl3)，超声波振荡20分钟，制备好的APS-BHHCT-Eu3+结合体保存备用。将环己烷、正辛醇和Triton X-100和水按一定比例(摩尔比为15～25∶2～7∶1∶6～10均匀混合后制成微乳液；再加入30μl的APS-BHHCT-Eu3+结合体溶液及200μl的正硅酸乙酯(TEOS)，用6％氨水(NH3占水相重量百分比)引发聚合，室温下搅拌反应24小时，离心分离后即得到含有共价键合BHHCT-Eu3+配合物的纳米稀土荧光微粒。
(2)共价键合BHHCT-Eu3+配合物的纳米荧光微粒的性质表征(a)纳米荧光微粒的形态及大小尺寸图1是共价键合BHHCT-Eu3+配合物的纳米荧光微粒的透射电子显微镜照片，从照片可见用共价键合的方法制备的纳米微粒与用硅胶包裹方法制备的纳米微粒有很明显的不同，用包裹方法制得的纳米微粒中由于铕离子会被集中到微粒中心，因此透射电镜照片上可以清晰地看到纳米微粒中心铕离子所形成的黑点，而用共价键合的方法制备的纳米微粒的中心看不到有黑点，且纳米微粒颜色均匀，无可见的明暗差别，这说明稀土铕离子已不是象用包裹的方法制得的纳米微粒那样主要聚集在微粒的中心，而是均匀地分布在整个纳米微粒当中。用该法制得的纳米微粒大小均匀，粒径尺寸为37±3nm。粒径的大小可以通过调整水与表面活性剂的比例、助表面活性剂的种类、氨水的浓度、TEOS的量以及反应时间等来进行调控。
(b)纳米稀土荧光微粒的荧光光谱特性图2是共价键合BHHCT-Eu3+配合物的纳米荧光微粒水溶液的荧光光谱和时间分辨荧光光谱。图中可见NP的荧光光谱的发光峰存在严重的散乱光干扰峰，而它的时间分辨荧光光谱的发光峰则彻底没有干扰峰的存在。自由配合物BHHCT-Eu3+的荧光光谱上其最大发光波长是612nm，而制成纳米荧光微粒后其荧光光谱的最大发光波长也是612nm，波长没有发生变化。该法制得的纳米荧光微粒的荧光寿命经测定为0.376秒，说明纳米荧光微粒的荧光仍保持了铕配合物的长荧光寿命的特征。
(c)纳米稀土荧光微粒的光稳定性实验共价键合BHHCT-Eu3+配合物的纳米荧光微粒的光稳定性实验结果如图3所示，所用光源为25W氘灯，样品距离氘灯12cm，每5分钟测量一次发射光谱。经强紫外光照射60分钟后，自由BHHCT-Eu3+配合物本身的荧光强度衰减到起始时的40.1％，而纳米荧光微粒的荧光强度仅衰减到起始时的84.2％，说明纳米微粒的抗光漂白能力远远强于自由BHHCT-Eu3+荧光配合物。
(d)共价键合BHHCT-Eu3+配合物的纳米荧光微粒与用直接硅胶包裹方法制备的BHHCT-Eu3+和BHHT-Eu3+配合物[4，4’-二(1”，1”，1”，2”，2”，3”，3”-七氟-4”，6”-己二酮-6”-基)-邻二苯基苯-铕配合物]纳米荧光微粒的荧光测定灵敏度比较为了比较采用共价键合BHHCT-Eu3+配合物方法与采用硅胶直接包裹方法制备的纳米微粒在荧光强度方面的差异，我们采用相同反应体系和相同初始配合物浓度(0.164μmol/ml)，分别用共价键合方法和硅胶包裹方法制备了纳米稀土荧光微粒，并测试了两种方法制得的纳米微粒的荧光测定灵敏度，具体测定结果见下表
在制备纳米微粒时反应体系中的铕配合物浓度完全相同，但是从表中结果可见，共价键合方法和硅胶包裹方法制备的纳米荧光微粒的荧光测定最低检测下限却相差很大，用共价键合方法制备的纳米微粒的最低检测下限可达0.41ng/ml(纳米粒子的重量/溶液体积)，而用硅胶包裹方法制备的纳米荧光微粒的最低检测下限只能达到87.5和382.6ng/ml，并且纳米微粒的粒径相近，由此可以得知用共价键合方法制备的纳米微粒的荧光强度要远远大于用硅胶包裹方法制备的纳米微粒的荧光强度，三种纳米微粒稀释溶液荧光测定的结果见图4。
实施例2使用共价键合BHHCT-Eu3+配合物的纳米荧光微粒作为标记物的时间分辨荧光免疫测定法测定人血清中的乙型肝炎表面抗原(简称HBsAg)。
(1)利用纳米稀土荧光微粒标记链亲和素(简称SA)取1mg纳米微粒分散到1.0ml的0.1mol/L磷酸缓冲溶液(pH＝7.1)中，用超声波振荡20分钟后，加入5mg牛血清白蛋白(简称BSA)，搅拌下加入300μl的1％戊二醛(磷酸缓冲溶液)，室温反应24小时，离心收集沉淀。沉淀用200μl磷酸缓冲液洗两次后加入到200μl的1％戊二醛(磷酸缓冲溶液)中，然后加入1mg SA，室温反应24小时后，加入0.5mg NaBH4还原，室温反应2小时，用磷酸缓冲溶液洗涤数次后悬浮于含有0.2％BSA-0.1％NaN3-0.9％NaCl的pH值7.8的0.05mol/L Tris-HCl缓冲溶液(缓冲溶液1)中备用，该标记法的反应原理见图5。
(2)生物素标记豚鼠抗人HBsAg抗体的制备1.4ml(0.5mg/ml)的豚鼠抗人HBsAg抗体(上海科华公司)在4℃，24小时对3L含0.9％NaCl的水溶液两次透析后，加入12mg的NaHCO3和3mg的NHS-LC-biotin(Pierce Chemical Co.)，室温搅拌1小时后，4℃下放置24小时。反应液在4℃，24小时对3L含有0.25g NaN3的0.1mol/L NaHCO3水溶液两次透析后加入10mg的BSA和20mg的NaN3，放置-20℃备用。当用于免疫测定时，用(缓冲溶液1)稀释1000倍后使用。
(3)人血清中HBsAg的测定(a)96微孔板的包被将含抗人HBsAg单克隆抗体(上海科华公司，10μg/ml)的0.1mol/L，pH值9.6的NaHCO3缓冲溶液50μl分注于96微孔板的各孔中，4℃，24小时包被后，用含有0.05％Tween 20的0.05mol/L，pH值7.8的Tris-HCl缓冲溶液(缓冲溶液2)洗两次，再用0.05mol/L，pH值7.8的Tris-HCl缓冲溶液(缓冲溶液3)洗1次，包被后的微孔板在-20℃下可保存1个月以上。
(b)HBsAg的时间分辨荧光免疫测定该测定的反应原理如图6所示。用含有0.01％BSA-0.9％NaCl-0.1％NaN3的pH值7.8的0.05mol/L Tris-HCl缓冲溶液注入上述包被后的微孔板的各孔中，37℃，1小时反应后用缓冲溶液2洗两次，缓冲溶液3洗1次。用含有5％BSA-0.9％NaCl-0.1％NaN3的pH值7.8的0.05mol/L Tris-HCl缓冲溶液(缓冲溶液4)稀释人HBsAg(Dakopatts，Denmark)制得HBsAg标准溶液。将此标准溶液和血清样品分别50μl注入上述包被后的微孔板的各孔中，37℃，1小时反应后，用缓冲溶液2，缓冲溶液3洗净，然后加入50μl生物素标记的抗HBsAg抗体溶液，37℃，1小时反应后，用缓冲溶液2，缓冲溶液3洗净，再加入50μ1 NP标记的SA溶液，37℃，1小时反应后，用含0.05％Tween 20的0.05mol/L，pH值9.1的Tris-HCl缓冲液洗4次，然后进行固相时间分辨荧光测定。测定用仪器为WALLAC VICTOR 1420多标记计数仪(PerkinElmerLife Science公司产)，测定条件为激发波长，340nm；检测波长，615nm；迟延时间，0.2ms；窗口时间，0.4ms；循环时间，1.0ms。
用该法测定HBsAg的工作曲线如图7所示，用零浓度时的荧光信号(本底)的标准偏差(SD)的3倍计算HBsAg测定的最低检出下限，得本法的最低检出下限为30pg/ml。工作曲线上限可达10ng/ml。
该法用于人血清样品中HBsAg添加回收率的测定结果和测定精度如下表所示，平均添加回收率的测定结果为95.9％，平均相对标准偏差为6.20％，说明本发明的方法用于人血清中HBsAg的测定具有非常好的准确度和精密度。
权利要求
1.β-二酮-三价铕配合物纳米荧光探针，其特征在于其是由可与硅酸酯共聚合的单体，与三价铕-β-二酮类荧光配合物于有机溶剂中发生共价键合反应，然后其再与硅酸酯发生共聚，形成的功能性纳米稀土荧光微粒；所述三价铕离子、β-二酮有机配位体、可与硅酸酯共聚合的单体及硅酸酯，它们之间的摩尔比例为1∶2～3∶10～100∶350～450。
2.按照权利要求1所述的β-二酮-三价铕配合物纳米荧光探针，其特征在于所述可与硅酸酯共聚合的单体为3-氨基丙基三烷氧基硅或3-巯基丙基三烷氧基硅。
3.按照权利要求1所述的β-二酮-三价铕配合物纳米荧光探针，其特征在于所述硅酸酯的分子式为Si(OR)4，其中的R是-CnH2n+1，n＝1～5。
4.按照权利要求1所述的β-二酮-三价铕配合物纳米荧光探针，其特征在于所述β-二酮有机配位体为二齿β-二酮类化合物或四齿β-二酮类化合物；二齿β-二酮类化合物，结构式可表示如下 式中R1＝C6F5或脂肪烃类取代基CnH2n+1，CnF2n+1，其中n＝1、2、3、4或5；R2为芳香烃类取代基 中之一；R3为氯磺酰基(-SO2Cl)、异硫睛基(-NCS)、氨基(-NH2)或肼磺酰基(-SO2NHNH2)；四齿β-二酮类化合物，结构式可表示如下 式中R4为氯磺酰基(-SO2Cl)、异硫睛基(-NCS)、氨基(-NH2)或肼磺酰基(-SO2NHNH2)；R5＝C6F5或脂肪烃类取代基CnH2n+1，CnF2n+1，其中n＝1、2、3、4或5。
5.一种权利要求1所述的β-二酮-三价铕配合物纳米荧光探针的制备方法，其特征在于具体操作过程为，1)荧光前躯体在室温条件下，在有机溶剂中，β-二酮有机配位体和可与正硅酸乙酯共聚合的单体发生共价结合反应，它们的用量摩尔比为1∶5～1∶50，体系中β-二酮有机配位体的摩尔浓度为0.05～0.9μmol/ml，然后加入β-二酮有机配位体摩尔量二分之一的Eu3+，制成荧光前躯体；2)配制微乳液将有机溶剂、助表面活性剂、表面活性剂和水按摩尔比为15～25∶2～7∶1∶6～10均匀混合后制成微乳液；3)在微乳液中加入荧光前躯体，室温条件下搅拌1小时后，加入硅酸酯，最后用重量含量3-25％的氨水引发聚合，搅拌下室温反应4～48小时，离心分离即可。
6.按照权利要求5所述的β-二酮-三价铕配合物纳米荧光探针的制备方法，其特征在于所述有机溶剂为苯、正己烷、环己烷或石油醚；助表面活性剂为乙醇、丙醇、异丙醇、正己醇、乙二醇、正辛醇或正癸醇；表面活性剂为聚氧乙烯基辛基苯基醚或聚氧乙烯基壬基苯基醚。
7.一种权利要求1所述的β-二酮-三价铕配合物纳米荧光探针在时间分辨荧光测定法中的应用。
8.按照权利要求7所述的β-二酮-三价铕配合物纳米荧光探针在时间分辨荧光测定法中的应用，其特征在于所述的时间分辨荧光测定法为时间分辨荧光免疫测定法，时间分辨荧光DNA杂交测定法，时间分辨荧光显微镜成象测定法，时间分辨荧光细胞测定法及时间分辨荧光生物芯片测定法。
全文摘要
本发明涉及一种β－二酮－三价铕配合物纳米荧光探针及其制备和应用，是由可与硅酸酯共聚合的单体，与三价铕－β－二酮类荧光配合物于有机溶剂中发生共价键合反应，然后其再与硅酸酯发生共聚，形成的功能性纳米稀土荧光微粒；所述三价铕离子、β－二酮有机配位体、可与硅酸酯共聚合的单体及硅酸酯，它们之间的摩尔比例为1∶2～3∶10～100∶350～450；所得微粒荧光更强，性能更稳定，表面具有可直接用于生物标记的活性官能团，作为荧光探针用于时间分辨荧光测定时不受各种散乱光和短寿命荧光的干扰，在时间分辨荧光的免疫检测、细胞化学、显微镜成像、DNA杂交测定及生物芯片测定等生化检测技术领域有重要的应用价值。
文档编号G01N21/64GK1566954SQ0313385
公开日2005年1月19日 申请日期2003年7月4日 优先权日2003年7月4日
发明者袁景利, 谭明乾, 海晓丹, 王桂兰 申请人:中国科学院大连化学物理研究所