专利名称：利用大豆天然提取物检测大豆抗蚜性的方法
技术领域：
本发明涉及一种农业虫害检测技术领域的方法，具体是一种利用大豆天然提 取物检测大豆抗蚜性的方法。
背景技术：
大豆蚜虫是大豆苗期的主要害虫之一。近年来随着气候变暖趋势加剧，大豆 蚜虫灾害发生的频率增加，大豆蚜虫已经成为我国大豆生产的主要虫害。2000 年以前大豆蚜虫危害主要发生在中国、菲律宾、泰国、朝鲜、韩国、印尼和俄罗 斯等国家，最近几年先后侵入美国、加拿大和澳大利亚。大豆蚜虫已成为世界范 围内的主要农业害虫之一。选育抗蚜或耐蚜的大豆品种是大豆生产迫切需要解决 的问题。
岈虫以植物韧皮部汁液为食，食性高度特化，其词喂技术及人工词料的研究 难度大，直至20世纪60年代初才有Mittler & Dadd及Auclair & Cartier取 得历史性突破，使得岈虫可在人工饲养条件下存活数周。Bradley RH在《Can J Microbiol》的《Effects of depth of stylet penetration on aphid transmission of potato virus Y》(嫁虫刺吸的深度对马铃薯病毒Y传播效应的影响.加拿大 微生物学杂志，1956年，第二巻第6期，第539-547页)一文中指出，Bradley 首次将parafilm M (泊拉膜)应用于蚜虫的人工饲料饲养技术中，并成功地检 测到带病毒的断虫在其口针刺进或穿过惰性基质时病毒的损失情况。ParafilmM 薄膜是美国Structure Probe， Inc.(结构探测有限公司)生产，商标为Parafilm ，是一种自动封口、可模压、韧性好的特制薄膜产品，广泛用于常规实验室， 包括常规电子显微实验室。Parafilm M薄膜具有独特的渗透性能，卓越的水汽 通透性能和很强抗腐蚀性能。它能够紧紧锁住水分，试剂滴落在Parafilm薄膜 表面上会形成一颗精致不流散的"水珠"，进而可对培养基试管、细颈瓶、培养 管及陪替氏培养皿中的物质提供很好的保护。
人工饲养嫁虫多采用类似Mittler and Dadd所采用的膜取食系统。不同类型的蚜虫饲育器虽然在大小、外型及具体的构成部件等方面均存在较大差异，但 都是由两个基本的部分组成 一、放置液态词料的饲料室，由双层拉薄的 Parafilm M薄膜以及人工饲料液滴构成；二、供蚜虫取食、活动的取食室，通 常为有底或无底的圆筒形玻璃或塑料容器，并作为膜的支持物。词养时，饲料室 固定于取食室的一端，将蚜虫放入取食室，在取食室的另一端围以纱网，防止蚜 虫逃逸，并可起到通风的作用。断虫口针可刺破Parafilm M薄膜吸食饲料，获 取所需的营养物质。
岈虫人工词养技术的出现，使得蚜虫在脱离寄主植物后得以短期或长期存 活。凭借这项技术，研究者们可以在小空间及特定的气候、生理试验条件下较方 便地进行蚜虫实验。研究者们可对蚜虫取食过程、蚜虫唾液分泌及排泄过程进行 观察，测定蚜虫对食物吸收以及氧消耗等指标。蚜虫人工饲养技术还可应用于蚜 虫传播病毒机制、营养生理、共生菌、毒理与杀虫活性物质的生物测定以及昆虫 与植物间相互关系等方面的研究，并已成为这些研究领域的重要实验手段。
经过对现有技术的文献检索发现，高月波和孙雅杰在《吉林农业大学学报》 2004年第26巻第4期第429_430页及第437页"利用人工饲料饲养蚜虫的技 术"中评述不同植株形态的大豆品种对大豆蚜虫的抗性也有差异,裸大豆通常 都表现较好的抗蚜性状,这可能是与其无毛性状有关,但具体的抗性机制并不明 晰，且在田间接虫进行大豆抗蚜性检测易受到植株形态、气候、温度等的影响。 杨振宇、本多健一郎、王曙明、马晓萍在《吉林农业科学》2004年第29巻第5 期第3 — 6页"中国东北抗蚜野生大豆重复检测的研究"中评述在人工气候箱 内可进行抗蚜重复检测，但是由于大豆植株较大，该方法不适合进行大批量大豆 品种的抗蚜性检测。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种利用大豆天然提取物检测 大豆抗蚜性的方法。本发明使大豆抗蚜性检测不受环境条件的影响，克服了大豆 抗岈性检测易受到植株形态、气候、温度等的影响等不足。同时本发明能够进行 大批量大豆品种的抗蚜性检测，快速准确区分大豆品种抗性之间的差异，从而可 以加快大豆抗蚜虫品系选育。
本发明是通过以下技术方案实现的，本发明包括具体步骤如下① 在大豆播种、出苗后，在子叶节下形成刀口；
② 提取大豆天然提取物取大豆苗，清洗干净，粉碎机粉碎，碾钵碾，提取 大豆天然提取物；
③ 制作天然提取物饲料过滤获得的天然大豆提取物，将过滤后的提取物滴 于薄膜夹中，分装；
④ 天然提取物饲料的保鲜采用钴一60射线辐射处理，冷冻贮存，保鲜贮 存大豆天然提取物饲料；
⑤ 控制嫁虫生长环境控制温度、光照、湿度、昼/夜光照的蚜虫生长环境；
⑥ 检测、筛选大豆抗蚜性的抗性品种和感蚜品种。
所述的大豆播种，是指每个品种取大豆种子10 — 20粒，播种在沙土中， 播种深度3cm—5cm，温度12。C一16i:，促进产生大豆次生代谢产物。
所述的产生大豆次生代谢产物，具体为在大豆出苗2—4天后，使用手术 刀在子叶节下0. 3cm_0. 5cm处形成长0. lmm_0. 3mm，深0. 05隨_1. OO腿的刀 口，促进大豆次生代谢产物的产生。
所述的提取大豆天然提取物，具体为在大豆出苗8 —IO天时，取大豆10 一20棵，清洗、冲洗，用小型粉碎机粉碎50 — 60秒后，放在碾钵里碾至大豆汁 液出现，获得大豆天然提取物2ml — 3ml。
所述的制作天然提取物饲料，具体为用直径为50mm，过滤孔径为0.22wm _0. 44u tn规格的水系微孔过滤膜过滤得到的天然提取物，然后将过滤后的提取 物以每个夹O. lml—O. 3ml的剂量滴于双层拉薄的Parafilm M薄膜夹中，分装成 天然提取物饲料。
所述的天然提取物饲料的保鲜，具体方法为将每个天然提取物词料分别编 号，每10个分装在一个塑料袋中。采用钴一60射线照射，选择照射剂量为2.0kGy 一3.0kGy，照射时间为3h—5h，然后在一20'C — _5(TC的低温冰箱冷冻贮存。 所述的控制蚜虫生长环境，具体为在面积为161112_201112的培养室内，温度 保持在23。C一25。C，光照强度为300umolm-2s-l — 320umolm-2s-l,相对湿 度为70%—80%，昼/夜光照为18/6h_16/8h。
所述的检测、筛选大豆抗蚜性，具体为在培养室中放置蚜虫饲育膜取食器， 每一个蚜虫词育膜取食器里放一种大豆的天然提取物词料，在取食器天然提取物
6词料上接种2 — 4只1龄幼虫，在之后第13 — 15天时测定大豆蚜虫的繁殖数量， 每个品种重复三次，经筛选获得抗性品系。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果和以往大豆抗岈性检测的方法 相比，本发明使大豆抗蚜性检测不受环境条件的影响，克服了大豆抗蚜性检测易 受到植株形态、气候、温度等的影响等不足。同时本发明的大豆天然提取物饲料 及其保鲜方法，能够保存试验样本和便于重复检测，从而能够进行大批量大豆品 种的抗蚜性检测，快速准确区分大豆品种抗性之间的差异，从而可以加快大豆抗 蚜虫品系选育工作。
具体实施例方式
以下实例将对本发明作进一步说明。本实施例在以本发明技术方案为前提下 进行实施，给出了详细的实施方式和过程，但本发明的保护范围不限于下述的实 施例。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制 造厂商所建议的条件。
实施例1
对抗、感品种杂交大豆的后代进行抗蚜性检测，母本品种东农42号表现感 蚜虫，父本品种P574表现抗蚜虫，杂交F2代80个品系进行抗岈虫检测。检测 步骤如下
① 大豆的生长培养，F2代80个大豆品系，每个品系取大豆种子10粒，播 种在沙土中，播种深度3cm，控制温度12'C;促进大豆次生代谢产物的产生，在 大豆出苗后2天，使用手术刀在子叶节下0. 3cm形成长0. lmm深0. 05mm的刀口 ， 促进大豆次生代谢产物的产生；
② 大豆品系天然提取物的提取，在大豆出苗8天时，取大豆10棵，用清水 清洗干净，然后用超纯水冲洗，用小型粉碎机粉碎50秒后，放在碾钵里碾至大 豆汁液出现，获得大豆品系天然提取物2ml;
③ 天然提取物饲料的制造，用直径为50mm，过滤孔径为0. 22um规格的水系 微孔过滤膜过滤得到的天然提取物，然后将过滤后的提取物以每个夹0. lml的剂 量滴于双层拉薄的Paraf ilm M薄膜夹中，分装成天然提取物饲料；
④ 天然代谢产物饲料的保鲜，将每个天然提取物饲料分别编号，每10个分 装在一个塑料袋中。采用钴一60射线，选择照射剂量2. OkGy，照射时间3h，然
7后在一20。C的低温冰箱冷冻贮存；
⑤ 蚜虫培养环境条件的控制，在16m4咅养室釆用Mittler and Dadd的蚜虫 饲育膜取食器，温度保持在23°C ，光照强度300 y molm-2s-l，相对湿度为70% ， 昼/夜光照为18/6h;
⑥ 大豆抗蚜虫性检测，每一个Mittler and Dadd蚜虫饲育膜取食器里放一 种大豆的天然提取物饲料，用毛笔在取食器天然提取物饲料上接种2只1龄幼虫， 在之后第13天时测定大豆蚜虫的繁殖数量，80个大豆品系，每个品系重复三次， 经筛选获得抗性品系。
检测结果，筛选得到的抗性品系06—5、 06_13、 06—19、 06—21、 06—22、 06_78、 06—80等61个，嫁虫表现是原来接虫数量的3倍，其余等19个感蚜 品系蚜虫表现是原来接虫数量的30倍，抗性基因呈单基因显性遗传方式，大豆 品系抗蚜性表现显著的差异。
实施例2
对抗、感品种杂交大豆的后代进行抗蚜性检测，母本品种交大02-89号表现 感蚜虫，父本品种P574表现抗蚜虫，杂交F2代90个品系进行抗蚜虫检测。检 测步骤如下
① 大豆的生长培养，F2代90个大豆品系，每个品系取大豆种子25粒，播 种在沙土中，播种深度4cm，控制温度14。C;促进大豆次生代谢产物的产生，在 大豆出苗后3天，使用手术刀在子叶节下0. 4cm形成长0. 2mm深0. 75ram的刀口 ， 促进大豆次生代谢产物的产生；
② 大豆品系提取物的提取，在大豆出苗9天时，取大豆15棵，用清水清洗 干净，然后用超纯水冲洗，用小型粉碎机粉碎55秒后，放在碾钵里碾至大豆汁 液出现，获得大豆品系天然提取物2.5ml;
③ 天然提取物饲料的制造，用直径为50mm，过滤孔径为0. 33um规格的水系 微孔过滤膜过滤得到的天然提取物，然后将过滤后的提取物以0. 2 ml/每个夹的 剂量滴于双层拉薄的Paraf ilm M薄膜夹中，分装成天然提取物饲料；
④ 将每个天然提取物饲料分别编号，每10个分装在一个塑料袋中。采用钴
一60射线，选择照射剂量2. 5kGy，照射时间4h，然后在35'C的低温冰箱冷冻贮 存；⑤ 蚜虫培养环境条件的控制，在18m^吝养室采用Mittler and Dadd的蚜虫 饲育膜取食器，温度保持在24°C，光照强度310u molm-2s-l，相对湿度为75%， 昼/夜光照为17/7h;
⑥ 大豆抗蚜虫性检测，每一个Mittler and Dadd蚜虫饲育膜取食器里放一 种大豆的天然提取物饲料，用毛笔在取食器天然提取物饲料上接种3只1龄幼虫， 在之后第14天时测定大豆蚜虫的繁殖数量，90个大豆品系，每个品系重复三次， 经筛选获得抗性品系。
检测结果，筛选得到的抗性品系09 — 1、 09_7、 09—16、 09 — 38、 09 — 53、 09—69、 09—90等65个，嫁虫表现是原来接虫数量的4倍，其余25个感蚜品 系蚜虫表现是原来接虫数量的35倍，抗性基因呈单基因显性遗传方式，大豆品 系抗蚜性表现显著的差异。
实施例3
对抗、感品种杂交大豆的后代进行抗蚜性检测，母本品种合丰45号表现感 蚜虫，父本品种P574表现抗断虫，杂交F2代100个品系进行抗蚜虫检测。检测 步骤如下
① 大豆的生长培养，F2代100个大豆品系，每个品系取大豆种子20粒，播 种在沙土中，播种深度5cm，控制温度16'C;促进大豆次生代谢产物的产生，在 大豆出苗后4天，使用手术刀在子叶节下0. 5cm形成长0. 3mm深1. OOmm的刀口 ， 促进大豆次生代谢产物的产生；
② 大豆品系天然提取物的提取，在大豆出苗10天时，取大豆20棵，用清水 清洗干净，然后用超纯水冲洗，用小型粉碎机粉碎60秒后，放在碾钵里碾至大 豆汁液出现，获得大豆品系天然提取物3ml;
③ 天然提取物词料的制造，用直径为50mm，过滤孔径为0.44um规格的水系 微孔过滤膜过滤得到的天然提取物，然后将过滤后的提取物以0. 3 ml/每个夹的 剂量滴于双层拉薄的Paraf ilm M薄膜夹中，分装成天然提取物饲料；
④ 将每个天然提取物词料分别编号，每10个分装在一个塑料袋中，把100 个天然提取物饲料装在一个塑料袋。天然提取物饲料的保鲜，把100个天然提取 物饲料装在一个塑料袋中，采用钴一60射线，选择照射剂量3. OkGy，照射时间 5h，然后在5(TC的低温冰箱冷冻贮存；⑤ 嫁虫培养环境条件的控制，在20r^培养室采用Mittler and Dadd的蚜虫 饲育膜取食器，温度保持在25°C，光照强度320 y molm-2s-l，相对湿度为80%， 昼/夜光照为16/8h;
⑥ 大豆抗蚜虫性检测，每一个Mittler and Dadd岈虫饲育膜取食器里放一 种大豆的天然提取物饲料，用毛笔在取食器天然提取物饲料上接种4只1龄幼虫， 在之后第15天时测定大豆蚜虫的繁殖数量，100个大豆品系，每个品系重复三 次，经筛选获得抗性品系。
检测结果，筛选得到的抗性品系02—6、 02 — 15、 02 — 32、 02—49、 02 — 73、 02—81、 02—96等78个，嫁虫表现是原来接虫数量的5倍，其余22个感蚜品 系蚜虫表现是原来接虫数量的40倍，抗性基因呈单基因显性遗传方式，大豆品 系抗蚜性表现显著的差异。
本实施例使大豆抗蚜性检测不受环境条件的影响，克服了大豆抗蚜性检测易 受到植株形态、气候、温度等的影响等不足。同时本发明的大豆天然提取物词料 及其保鲜方法，能够保存试验样本和便于重复检测，进而能够进行大批量大豆品 种的抗蚜性检测，快速准确区分大豆品种抗性之间的差异，从而可以加快大豆抗 蚜虫品系选育工作。
权利要求
1、一种利用大豆天然提取物检测大豆抗蚜性的方法，其特征在于，包括步骤如下①在大豆播种、出苗后，在子叶节下形成刀口；②提取大豆天然提取物取大豆苗，清洗干净，粉碎机粉碎，碾钵碾，提取大豆天然提取物；③制作天然提取物饲料过滤获得的天然大豆提取物，将过滤后的提取物滴于薄膜夹中，分装；④天然提取物饲料的保鲜采用钴—60射线辐射处理，冷冻贮存，保鲜贮存大豆天然提取物饲料；⑤控制蚜虫生长环境控制温度、光照、湿度、昼/夜光照的蚜虫生长环境；⑥检测、筛选大豆抗蚜性的抗性品种和感蚜品种。
2、 根据权利要求1所述的利用大豆天然提取物检测大豆抗蚜性的方法，其 特征是，所述的大豆播种，是指每个品种取大豆种子10_20粒，播种在沙土中，播种深度3cra—5cm，温度12°。一16"，产生大豆次生代谢产物。
3.根据权利要求2所述的利用大豆天然提取物检测大豆抗蚜性的方法，其 特征是，所述的产生大豆次生代谢产物，具体为在大豆出苗2 — 4天后，使用 手术刀在子叶节下0. 3cm—0. 5cm处形成长0. lmra—O. 3mm，深0. 05mm—l. OOmm 的刀口，促进大豆次生代谢产物的产生。
4、 根据权利要求1所述的利用大豆天然提取物检测大豆抗蚜性的方法，其 特征是，所述的提取大豆天然提取物，具体为在大豆出苗8 — 10天时，取大豆 10 — 20棵，清洗、冲洗，用小型粉碎机粉碎50 — 60秒后，放在碾钵里碾至大豆 汁液出现，获得大豆天然提取物2ml — 3ml 。
5、 根据权利要求1所述的利用大豆天然提取物检测大豆抗蚜性的方法，其 特征是，所述的制作天然提取物饲料，其方法为以过滤膜过滤得到的天然提取 物，然后将过滤后的提取物以每个夹0. lml—O. 3ml的剂量滴于薄膜夹中，分装成 天然提取物饲料。
6、 根据权利要求5所述的利用大豆天然提取物检测大豆抗蚜性的方法，其特征是，所述的过滤，是指用直径为50mm，过滤孔径为0.22um—0.44ym的水系微孔过滤膜过滤。
7、 根据权利要求5所述的利用大豆天然提取物检测大豆抗蚜性的方法，其特征是，所述的薄膜夹，是指提取物在双层拉薄的Parafilm M薄膜夹中分装。
8、 根据权利要求1所述的利用大豆天然提取物检测大豆抗岈性的方法，其特征是，所述的天然提取物词料的保鲜，其方法为将每个天然提取物饲料分别编号，每10个分装在一个塑料袋中。釆用钴_60射线照射，选择照射剂量为2.0kGy—3.0kGy，照射时间为3h—5h，然后在一20。C一一5(TC的低温冰箱冷冻贮存。
9、 根据权利要求1所述的利用大豆天然提取物检测大豆抗蚜性的方法，其特征是，所述的控制顿虫生长环境，其方法为在面积为16m2—20m2的培养室内，温度保持在23。C一25。C，光照强度为300u molm-2s-1 — 320 umolm-2s-l，相对湿度为70%_80%，昼/夜光照为18/6h—16/8h。
10、 根据权利要求1所述的利用大豆天然提取物检测大豆抗蚜性的方法，其特征是，所述的检测、筛选大豆抗蚜性，其方法为在培养室中放置蚜虫饲育膜取食器，每一个蚜虫词育膜取食器里放一种大豆的天然提取物饲料，在取食器天然提取物饲料上接种2_4只1龄幼虫，在之后第13 — 15天时测定大豆蚜虫的繁殖数量，每个品种重复三次，经筛选获得抗性品系。
全文摘要
一种植物抗虫技术领域的利用大豆天然提取物检测大豆抗蚜性的方法，包括以下步骤在大豆播种、出苗后，在子叶节下形成刀口；大豆天然提取物的提取；天然提取物饲料的制造；天然提取物饲料的保鲜；蚜虫培养环境的控制；大量的大豆抗蚜虫性检测。和以往大豆抗蚜性检测的方法相比，本发明使大豆抗蚜性检测不受环境条件的影响，克服了大豆抗蚜性检测易受到植株形态、气候、温度等的影响等不足。同时本发明能够进行大批量大豆品种的抗蚜性检测，快速准确区分大豆品种抗性之间的差异，从而可以加快大豆杂交抗蚜虫品系选育工作。
文档编号G01N33/00GK101477098SQ20091004505
公开日2009年7月8日 申请日期2009年1月8日 优先权日2009年1月8日
发明者姚陆铭, 姜伊娜, 武天龙, 彪 王, 王克忠 申请人:上海交通大学