从大豆中提取叶酸的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于植物提取物的制备，具体地涉及一种大豆种子的提取和含量的测定方 法。
【背景技术】
[0002] 叶酸是水溶性B维生素，叶酸缺乏会引起婴儿神经管缺陷、癌症和心血管疾病等严 重的健康问题（Kimetal.，1998;Geisel，2003;Choi&Friso,2005;Ma;risaetal. ,2005)。 人类和动物不能自身合成叶酸，各种作物是人类和动物获取这一维生素的主要来源。然而， 在作物中叶酸的含量通常很低，尤其是在谷物中含量更低，如何获得作物中各种叶酸衍生 物含量的可靠数据是这一研究领域的关键问题。作物中叶酸的提取，常用的有单酶法和三 酶法。单酶法针对菠菜、黄瓜、卷心菜和香蕉等食物中的叶酸提取有效（Iwatanietal.， 2003;Zhangetal.，2005)。三酶法对谷物类，土豆，豆类等的叶酸含量的提取效率高于单 酶法，三酶法相对于单酶法能够更完全地提取富含碳水化合物或蛋白基质的叶酸（De Souza&Eitenmiller，1990;Tamuraetal，1997;Pffeiferetal，1997;Raderetal, 1998 ;Ais〇&Tamura，1998)dyun等（2005)研究的食物叶酸提取步骤，适量样品在提取液中 研磨成匀浆，匀浆液分装后冻存于_70°C直至叶酸提取，加入蛋白酶处理样品后，100°C煮沸 样品灭活蛋白酶，再利用α-淀粉酶和叶酸辄合酶共同孵育样品2小时，经离心后获取叶酸样 品，与-7 0 °C冻存样品。但是不同食物中使用的三酶法提取条件是不同的（Aisο&Tamura， 1998;Pandrangietal. ,2004)，有必要对每种类型食物分别进行叶酸提取的优化。
[0003]目前国内国际流行的作物中叶酸含量检测方法是微生物法和高效液相色谱法。高 效液相色谱法利用C18色谱柱进行样品分离后，结合紫外吸收，荧光检测和电化学检测能够 对单个叶酸组分进行定量分析。高效液相色谱法能够快速、高效地分离不同叶酸衍生物，样 品用量少，但是该方法的灵敏度低于微生物法，而且内源叶酸会干扰叶酸测定，给某些形式 的叶酸定量带来困难（Zhangetal.，2005;P0o_Prietoetal· ,2006)。微生物法 (MicrobiologicalAssay)是检测叶酸的经典方法，其原理是指示菌对叶酸的所有衍生物 具有相同的生长反应速度，在一定条件下，微生物的生长繁殖与培养基中叶酸含量呈正比 关系，根据微生物对样品中叶酸的吸收程度从而对叶酸进行定量(常娜宁等，2010)。酪乳酸 杆菌对单谷氨酸叶酸、二或三谷氨酸叶酸及其还原型衍生物均敏感，是最为常用的菌种 (Hyunetal. ,2005)。叶酸分析中要求不同样品具有适当的稀释倍数，使用96孔酶标板对 指示菌进行18-24h培养，并在分光光度计读取数值后计算样品中叶酸的含量。微生物法灵 敏度高，结果准确，但重复性较差，而且只能检测总叶酸含量，但优点是不需要贵重的仪器 或药品，所以成本较低，适用于大批量的样品检测。
[0004] 综上，有必要对大豆叶酸三酶法提取和微生物检测的方法进行优化，确定三种酶 的最佳配比和微生物法检测的步骤，为筛选高叶酸含量的大豆优异种质提供科学的依据。
【发明内容】
[0005]发明旨在解决现有技术中存在的技术问题，本发明的目的在于提供一种大豆种子 叶酸的提取和含量检测方法，旨在建立三酶法提取及微生物检测大豆种子中叶酸含量的方 法，为筛选高叶酸含量的大豆优异种质提供科学的依据。
[0006]本发明用到的材料和仪器如下：
[0007]一、材料和试剂
[0008] 常规药品为国产分析纯试剂；磷酸缓冲液(AMERES⑶公司生产）；叶酸（Sigma公 司）;α-淀粉酶(来源于米曲霉)和蛋白酶(来源于链霉素）（Sigma公司）；大鼠血清（中科晨宇 (北京)贸易有限公司）；乳酸菌液体培养基和叶酸培养基购自北京鼎国生物技术有限公司； 乳酸菌菌株购自北京中原合聚经贸有限公司；
[0009]二、仪器与设备
[001 0]AXYGEN系列EP管（自经科宏达公司）；叶酸检测试剂盒(P1001)购自德国拜发生物 有限公司；高通量组织研磨机SPEXGeno2000(美国SPEX公司生产）；3-30K高速台式冷冻离 心机（德国SIGMA);酶标仪（美国DynexMagellanBiosciences)。
[0011] 本发明提供了一种大豆种子叶酸的提取方法，包括以下步骤：
[0012] (1)大豆样品制备：大豆种子粉碎获取豆粉，称取0.2g豆粉，置于AXYGENEP管中， 在样品中加入750yL叶酸提取缓冲液，95°C孵育15min置于冰上冷却，加入5mm钢珠(2粒），在 组织研磨机中研磨样品，获得样品匀浆液；
[0013] (2)大豆叶酸提取:在步骤（1)样品匀浆液中加入8yLa-淀粉酶和750yL叶酸提取缓 冲液以避免粘稠，室温放置lOmin，加入100yL蛋白酶，37°C孵育lh;100°C煮沸lOmin，冰上迅 速冷却1〇111；[11;在4°0，14000印1]1条件下，离心1〇1]1；[11 ;吸取上清，按照2%的体积比在上清中加 入大鼠血清10yL，混匀后，于37°C培养2h;100°C煮沸灭活10min，冰上迅速冷却lOmin;在4 °C，14000rpm条件下，离心15min;吸取上清分装于灭菌管中直接测定或冻存于-80°C，得大 豆叶酸提取液。
[0014]另外，根据本发明上述实施例大豆种子叶酸的提取方法还可以具有如下附加的技 术特征：
[0015] 所述大豆样品制备步骤一中所述在组织研磨机中研磨的转速为1400rpm，时间为 5min。所述大豆样品制备步骤一中所述研磨均需在避光条件下操作，大豆叶酸提取步骤均 需在避光条件下操作。
[0016]所述大豆样品制备步骤二中所述缓冲液的组分为pH值6.5的50mM磷酸缓冲液，加 入1 %的抗坏血酸钠盐，以及0.1 %的2-巯基乙醇。
[0017]本发明的第二个目的，是提供了一种大豆种子叶酸含量的测定方法，包括以下步 骤：
[0018]一、乳酸菌液体培养基的配制：将4.85g乳酸菌液体培养基加入100mL水中，121°C灭菌15min;
[0019]二、低叶酸培养基的配制：称取4.7g叶酸培养基粉末、0.03g抗环血酸、0.3mL叶酸 标准储配液，加水溶解定容至100mL，过0.22μπι滤膜灭菌备用；
[0020]三、分析缓冲液的配制：称取Na2HP〇4.2H20 0.388、恥!^〇4〇.938、抗环血酸18加水 溶解定容至100mL，过0.22μπι滤膜灭菌备用；
[0021 ]四、叶酸培养基的配制：称取叶酸培养基粉末9.4g，加水溶解定容至100mL，煮沸 5min，过0.22μηι滤膜灭菌备用；
[0022] 五、叶酸标准样品制备:称取28mg叶酸溶于4mL5%的1(册04溶液中，然后用分析缓 冲液定容至250mL，再吸取0.5mL此溶液用步骤三制得的分析缓冲液定容至100mL，得浓度为 0.5yg/mL的标准储备液FA，分装到1.5mLEP管中并保存于-20°C;
[0023] 六、指示菌的制备：吸取乳酸菌保存菌液500yL加入到10mL乳酸菌液体培养基中， 37°C摇床培养24h，再次吸取培养好的菌液0.5mL加入到100mL低叶酸培养基中，37°C摇床培 养18h;三角瓶置于冰上冷却20min;将预冷的甘油与培养物混合(体积比为40:60)，充分搅 拌均匀;分装菌液于1.5mLEP管中，液氮速冻后于-80°C保存；
[0024]七、叶酸含量测定:利用步骤一制得的分析缓冲液将步骤五制得的FA溶液稀释250 倍，得到FA-1溶液，按照2:1比例利用分析缓冲液稀释，得到FA-2溶液;FA-1和FA-2溶液均用 于制作标准曲线;将叶酸样品短暂离心，用分析缓冲液稀释样品30倍;在96孔板中，将150yL 分析缓冲液加入每个样品孔后，再将150yLFA-1、FA-2和大豆叶酸待测液分别加入96孔板 的第1列，从第1列吸取混合液150μ1至第2列，在从第2列吸取混合液150μ1至第3列，再从第3 列吸取混合液150μ1至第4列，在从第4列吸取混合液150μ1至第5列，再从第5列吸取混合液 150μ1至第6列，最后将第6列的样品混合液弃去其中150μ1;将加入指示菌的FACM培养基150 yL加入96孔板中；将培养板置于37°C培养18-20h;在波长为580nm条件下，测定样品的0D值； 根据测定数值建立标准曲线并计算出样品中包含的叶酸浓度。
[0025]本发明的技术效果在于：
[0026] 1、本发明采用的样品研磨方法来替代手动磨样或搅拌机研磨方法，可以同时对上 百个样品同时进行提取，在高效完成提取过程的同时减少了试验误差。
[0027] 2、本发明选取可来源于米曲霉的α_淀粉酶及来自链霉菌的蛋白酶和大鼠血清来 提取大豆中的叶酸。
[0028] 3、本发明确定了α-淀粉酶、蛋白酶和大鼠血清的组合在8yL，100yL及10yL的条件 下能够最大程度地提取大豆种子中的叶酸。
[0029] 4、本发明确定了微生物法测定叶酸含量的方法:将叶酸标准样品用分析缓冲液稀 释250倍，得到FA-1溶液，按照2:1比例利用分析缓冲液稀释，得到FA-2溶液;FA-1和FA-2溶 液均用于制作标准曲线;将叶酸样品短暂离心，用分析缓冲液稀释样品30倍;在96孔板中， 将150yL分析缓冲液加入每个样品孔后，再将15