一种检测红斑狼疮易感基因的试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种检测红斑狼疮易感基因的试剂盒。该试剂盒包括同时检测HLA-DQA1基因上rs9271366号SNP位点、IRF5基因上rs2004640号SNP位点、STAT4基因上rs7574865号SNP位点的特异性引物对及特异性荧光探针对、用于荧光定量PCR检测的常规组件等。本发明的试剂盒通过同时检测与红斑狼疮密切相关的HLA-DQA1、IRF5、STAT4的单核苷酸多态性位点基因型来评估个体罹患红斑狼疮的风险性。
【专利说明】一种检测红斑狼疮易感基因的试剂盒
【技术领域】
[0001]本发明涉及分子生物学和医学领域，更具体的，本发明涉及一种检测红斑狼疮易感基因的试剂盒，通过同时检测与红斑狼疮关联的基因HLA-DQAl、IRF5和STAT4的单核苷酸多态性位点基因型来评估个体罹患红斑狼疮的风险性。
【背景技术】
[0002]红斑狼疮(LE)是一种临床上有多种表现、可累及全身多个组织器官的自身免疫性疾病。根据其临床表现特点，组织病理，免疫学指标等将其定性为一种病谱性疾病,分为三个亚型:(1)盘状红斑狼疮(DLE)，(2)亚急性皮肤性红斑狼疮(SCLE)，(3)系统性红斑狼疮(SLE).部分SCLE可以发展成SLE，而DLE —般不发展为SLEfJJ。系统性红斑狼疮临床表现最重，累计多个脏器，对生活质量的影响最重。
[0003]自1882年Biett最早描述系统性红斑狼疮至今，其病因发病机制尚未完全明确，但有大量证据表明机体的遗传因素在该病的易感性及其表达方面有着重大的作用。如同卵双生子患者中，共同患病达65%，明显高于异卵双生子的共同患病率9 %，所有患者中，4%具有家族性。在美国，黑人SLE的发病率是白人的3倍，但非洲黑人的发病率并不高。在我国，SLE的发病率也明显高于其他东方国家与西方人，由此可见，SLE具有家族遗传性和种族遗传性。
[0004]目前，涉及红斑狼疮的一些基因，已经很好的进行研究。其作用机制、生化功能、信号通路、调控、转录等等方面有明确可靠的研究结果；研究手段、方法、仪器设备和试剂都已经发展到了一个相当高的程度。目前，经证实并且机理研究清楚的与红斑狼疮密切相关的基因有HLA-DQAl基因、IRF5基因和STAT4基因。
[0005]自1995年潘星华等首次报告中国汉人SLE易感性与HLA_DQA1*0101、HLA-DQAI*0401相关，HLA_DQA1*0501和HLA_DQA1*0601有遗传抵抗作用以来，中国大陆已有7项独立研究探讨了 SLE与HLA-DQAl基因的关联性。后又有研究人员通过Meta分析增大了样本量，纳入447例SLE患者和503例正常刘照，定量综合中国大陆人群多个研究结果，得出量化的平均效果和联系，增加了结论的把握度，解决了研究结果的不一致性。
[0006]据研究显示，HLA-DQA1*0301是中国大陆人群SLE保护基因。HLA-1I类分子在抗原处理和递呈中具有重要作用，人们推测不同HLA-DR基因可能因其基因型别不同，与抗原肽结合的结合槽或与CD4T细胞结合部位的氨基酸残基不同，这种氨基酸的理化性质变化可导致其结合能力的变化，从而影响免疫反应，决定了对SLE的易感性差异。
[0007]HLA II类基因是人类基因组最具多态性的区域，同一基因位点具有多个等位基因，并且随着研究的深入，越来越多的基因亚型被发现和鉴定。HLA*DQA1与疾病的关联研究，也越来越深入和细致。
[0008]在HLA-1I类基因位点中，以研究DR、DQ与SLE相关性为多，也已表明SLE与HLA-D区多态性基因相关，而且不同种族和地区的SLE与HLA的关联不同。20世纪90年代，Skarsvag 等发现北欧白人 SLE 与 HLA_DRB1*03、_DRB1*0101、DQA1*0501、DQB1*0201 关联。Coward 等的研究表明丹麦人 SLE 与 HLA_DRBl*03/06、_DR3*01/03、DQA1*0501、DQB1*0201相关。Dong 等人发现日本人 SLE 与 HLA-DRB1*1501、-DRB5*0101、DQA1* 0102、DQB1*0602单倍型相关。Doherty等1992年应用PCR-SSO技术对源于中国南方的马来西亚华裔SLE患者的研究揭示了与HLA-DR15 (DR2)、DQ1相关，但未见与任何DQA1、DQBl等位基因关联，认为SLE易感基因可能在DR位点近端。
[0009]由IRF5介导诱导IFN- a、IFN- ^及一些细胞因子(IL_6、TNF等)表达，激活IFN下游靶基因。IRF5表达增高后，从而激活特异性的获得性免疫，诱导产生自身抗体，引起病理损伤。
[0010]IRF5还参与了细胞凋亡过程。IRF5信号转导途径的下游蛋白质包括Bax、胱天蛋白酶_8、胱天蛋白酶-3和Fas结合 死亡域蛋白质/胱天蛋白酶-8,活化的IRF5激活胱天蛋白酶级联反应，使线粒体释放细胞色素C，改变线粒体膜电位，改变细胞膜的对称结构，导致DNA断裂和细胞凋亡。
[0011]信号传导和转录激活子4 (STAT4)基因位于人类染色体2q32.2^32.3是信号转导和转录活化因子家族成员之一，其表达主要分布于淋巴细胞、巨噬细胞及树突状细胞中。3丁八14可以被白细胞介素(10-12、IL-23以及I型干扰素等一些重要细胞因子所诱导。STAT4存于胞质中，经细胞因子激活而磷酸化的STAT4转入并积累于细胞核中，进而刺激其他特异基因的转录，例如作为T细胞分化为Thl细胞的重要指标物的干扰素(IFN)-Y。由此可见，IL-12介导的STAT4依赖性信号通路在Thl型T淋巴细胞生成过程中起了关键的作用。此外，也发现STAT4与Thl7这一新定义的⑶4*T淋巴细胞谱系成员的分化有关。促炎症反应的Thl7细胞部分依赖于与IL-12相关的细胞因子IL-23的活性，进而在一定程度上引起慢性炎症紊乱。与此同时，IFN-Y的生产有抑制Thl7分化通路的趋势。总而言之，STAT4在自身免疫系统中起着至关重要的作用。
【发明内容】
[0012]基于HLA-DQAl基因、IRF5基因、STAT4基因上的3个SNPs位点多态性可用来评估个体罹患红斑狼疮风险性的基础上，本发明提供一种检测红斑狼疮易感基因的试剂盒。
[0013]试剂盒包括:
检测HLA-DQAl基因上rs9271366号SNP多态性基因型的特异性引物对及特异性荧光探针对；
检测IRF5基因上rs2004640号SNP多态性基因型的特异性引物对及特异性荧光探针对； 检测STAT4基因上rs7574865号SNP多态性基因型的特异性引物对及特异性荧光探针对；
荧光定量PCR反应组件(包括Taq酶、dNTP混合液、MgCl2溶液、反应缓冲液、去离子水
[0014]本试剂盒中所述的特异性引物对是指针对HLA-DQAl基因上rs9271366号SNP位点、IRF5基因上rs2004640号SNP位点、STAT4基因上rs7574865号SNP位点而设计，能特异性扩增出包含这三个SNPs位点的DNA片段的引物对。设计这类引物对是本领域技术人员能够轻易完成的。优选地，试剂盒中包含具有SEQ ID N0:1和2、3和4、5和6所示序列的引物对。特异性引物对可用常规的合成技术进行合成。本领域的技术人员能够理解，本发明的引物不限于这三对引物。
[0015]本试剂盒中所述的特异性荧光探针对是指针对HLA-DQAl基因上rs9271366号SNP位点、IRF5基因上rs2004640号SNP位点、STAT4基因上rs7574865号SNP位点而设计，能通过荧光定量PCR技术特异性检测出这三个SNPs位点基因型的Taqman探针对。设计这类探针是本领域技术人员能够轻易完成的。优选地，试剂盒中包含具有SEQ ID N0:7和8、9和10、11和12所示序列的Taqman探针对。特异性荧光探针对可用常规的探针合成技术进行合成。本领域的技术人员能够理解，本发明的特异性荧光Taqman探针对不限于这三对探针，所有可用于荧光定量PCR法检测本发明中所述用来评估个体罹患红斑狼疮风险性的三个SNPs位点的探针均在本发明范围内。
[0016]本发明试剂盒的组分和含量包括:
5W 10 X荧光定量PCR反应缓冲液，
0.5m 25mM dNTP 混合液，
3m 25mM MgCl2 溶液，
0.125m (5unitsM) Taq DNA 聚合酶，
20剛特异性引物对每条引物各0.225^1,
10剛特异性荧光探针对每条探针各0.25^1,
去尚子水26.625M-1 o
[0017]本试剂盒供一人份检测应用，试剂盒的保存温度为_20°C。
`[0018]
【具体实施方式】:
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照厂商所建议的条件。
[0019]
实施例1.检测试剂盒的使用 步骤1:DNA模板的提取
用真空采血管采集人体外周血，提取血液中的基因组DNA。
[0020]步骤2:荧光定量PCR反应
使用可检测红斑狼疮易感基因的荧光定量PCR检测试剂盒，其中，包含下列引物对和荧光探针对:
有义引物 1:5，- CACGTAATATAAATG - 3，(SEQ ID NO:1)
反义引物 1:5’ - CCTAATTCCAAAGCC - 3’ (SEQ ID NO:2)
有义引物 2:5’- GCTGCGCCTGGAAAG - 3，(SEQ ID NO:3)
反义引物 2:5’- CGGGCGCACCCTGCT - 3，(SEQ ID NO:4)
有义引物 3:5’- TATGAAAAGTTGGTG - 3，(SEQ ID NO:5)
反义引物 3:5’- CCACTGAAATAAGAT - 3’ (SEQ ID NO:6)
带 VIC 荧光基团探针 1:5，- CAAAAGaAGGGT -3，(SEQ ID NO:7)
带 FAM 荧光基团探针 1:5’ - CAAAAGgAGGGT -3’ (SEQ ID NO:8)
带 VIC 荧光基团探针 2:5’ - CTCGGGgGGGTG -3，(SEQ ID NO:9)
带 FAM 荧光基团探针 2:5’ - CTCGGGtGGGTG -3’ (SEQ ID NO:10)带 VIC 荧光基团探针 2:5’ - AAATGTgAATAG -3，(SEQ ID NO:11)
带 FAM 荧光基团探针 2:5，- AAATGTtAATAG-3’ (SEQ ID NO:12)
有义引物1，反义引物1、带VIC荧光基团探针1、带FAM荧光基团探针I特异地针对检测HLA-DQAl基因上rs9271366号SNP位点多态性；
有义引物2，反义引物2、带VIC荧光基团探针2、带FAM荧光基团探针2特异地针对检测IRF5基因上rs2004640号SNP位点多态性；
有义引物3，反义引物3、带VIC荧光基团探针3、带FAM荧光基团探针3特异地针对检测STAT4基因上rs7574865号SNP位点多态性；
3个SNPs位点分别进行3次独立的荧光定量PCR反应，每个反应的体系为总体积IOW，包含浓度为20ng/W的DNA模板2W、1W 10 X荧光定量PCR反应缓冲液、0.1W 25mMdNTP 混合液、0.6W 25mM MgCl2 溶液、0.025W (5unitsM) Taq DNA 聚合酶、20剛的有义引物和反义引物各0.225W、10剛的带VIC荧光探针和带FAM荧光探针各0.25W，去离子水
5.325)^1 o
[0021]在ABI9700型PCR扩增仪上进行反应，反应条件为50°C、2分钟，95°C、10分钟，进行60个循环的95°C、30秒，60°C、I分钟。反应结束后在ABI7900型荧光定量PCR仪上读取
样品突光量。
[0022]步骤3 =SNP基因型分析
熟悉荧光定量PCR技术的本领域技术人员能够通过辨识荧光定量PCR仪上显示的最终样品荧光量，根据不同序列探针VIC和FAM荧光信号的强弱即可确定所检测的SNP位点的
基因型。
[0023]实施例2.对患者进行红斑狼疮易感基因检测的服务 步骤1:DNA提取
由医院检验科医师对被检者进行外周血的采集，采用真空采血管采集外周血，并提取出其中的基因组DNA。
[0024]步骤2:基因分型检测
使用本发明提供的试剂盒，对被检者基因组DNA的HLA-DQAl基因上rs9271366号SNP位点、IRF5基因上rs2004640号SNP位点、STAT4基因上rs7574865号SNP位点分别进行荧光定量PCR检测，确定这两个SNPs位点的基因型。
[0025]步骤3:个体罹患红斑狼疮风险性的分析
通过对被检测者SNPs基因型的分析， 出具罹患红斑狼疮风险性的分析报告单。报告中详细说明了被检测者罹患红斑狼疮风险性的高低，并由医师向被检测者详细说明和解读罹患红斑狼疮风险性的分析报告单。
【权利要求】
1.一种检测红斑狼疮易感基因的试剂盒，其特征在于:包括同时检测HLA-DQAl基因上rs9271366 号 SNP 位点、IRF5 基因上 rs2004640 号 SNP 位点、STAT4 基因上 rs7574865 号SNP位点的特异性引物对及特异性荧光探针对、Taq酶、dNTP混合液、MgCl2溶液、荧光定量PCR反应缓冲液、去离子水。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于:所述的特异性引物对是指针对HLA-DQAl 基因上 rs9271366 号 SNP 位点、IRF5 基因上 rs2004640 号 SNP 位点、STAT4 基因上rs7574865号SNP位点而设计，能特异性扩增出包含这3个SNPs位点的DNA片段的引物对。
3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于:所述的特异性荧光探针对是指针对HLA-DQAl 基因上 rs9271366 号 SNP 位点、IRF5 基因上 rs2004640 号 SNP 位点、STAT4 基因上rs7574865号SNP位点而设计，能通过荧光定量PCR技术特异性检测出这3个SNPs位点基因型的Taqman探针对。
4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于:所含的特异性引物对选自具有SEQIDNO:1和2、3和4、5和6所示序列的引物对。
5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于:所含的特异性荧光探针选自具有SEQID NO:7和8、9和10、11和12所示序列的Taqman探针对。
6.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于:试剂盒的组分和含量包括10X荧光定量 PCR 反应缓冲液、0.5Pl 25mM dNTP 混合液、3Pl 25mM MgCl2 溶液、0.125W (5unitsM)Taq DNA聚合酶、20剛特异性引物对每条引物各0.225W、10剛特异性荧光探针对每条探针各0.25沿、去离子水26.625W，`本试剂盒供一人份检测应用，试剂盒的保存温度为-20°C。
【文档编号】G01N21/64GK103667434SQ201210360001
【公开日】2014年3月26日 申请日期:2012年9月25日 优先权日:2012年9月25日
【发明者】任峻, 张华忠 申请人:浙江爱易生物医学科技有限公司