基于抗原特异性TNF-α-ELISA检测活动性结核病的试剂盒及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种基于抗原特异性TNF-α-ELISA检测活动性结核病的试剂盒及其应用，该试剂盒包括：包被TNF-α抗体的酶标板、TNF-α蛋白标准品、ESAT-6和CFP-10的蛋白液、生物素标记TNF-α抗体和亲和素标记的辣根过氧化物酶。本发明应用基于TNF-α-ELISA检测活动性结核病的试剂盒，可以建立一种区分活动性与潜伏性结核感染的方法，通过ELISA技术定量检测结核特异性抗原ESAT-6和CFP-10刺激条件下外周血单个核细胞释放的TNF-α，以及非刺激情况下外周血单个核细胞释放的本底TNF-α，通过以上两者相减得到抗原特异性TNF-α值，从而对活动性结核病进行直接诊断。
【专利说明】基于抗原特异性TNF- a -ELISA检测活动性结核病的试剂盒及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及ELISA试剂盒应用领域，具体地指一种基于抗原特异性TNF- a -ELISA检测活动性结核病的试剂盒及其应用。
【背景技术】
[0002]结核是威胁人类健康的重大疾病之一，主要引起肺部疾病，其发病率和死亡率均居高不下。历史上，结核病曾在世界上广泛流行，数亿人被夺走生命。20世纪50年代以来，抗结核药物不断被发现，使结核病的流行得到了一定的控制。近年来，由于有些国家对结核病防治工作的忽视，加上流动人口增加、艾滋病感染者的传播以及耐药结核菌株不断出现等因素，使结核病流行有所回升。目前全世界每年新增病例800万，每年有200万人死于结核菌感染。因此，世界卫生组织已宣布进入“全球结核病紧急状态”，并将每年的3月24日定为“世界防治结核病日”。
[0003]面对如此严峻的形势，我们应该及早采取措施。结核病的早期诊断及有效治疗是结核病防治工作的重中之重，对于控制结核菌传播有着重要的临床意义。目前国内大多数医院根据直接涂片镜检和结核分枝杆菌培养技术对活动性结核进行诊断。结核菌涂片检查虽然简单易行且准确性高，但阳性率低。结核菌培养检测结果可信度高，但耗时较长，不能满足临床需求。此外，结核菌素皮试(pro)实验是目前国内诊断结核菌感染的主要依据。此法简单易行且费用低，但是其最大缺点在于pro试验所用抗原为结核分枝杆菌粗提的抗原混合物，和许多非结核分枝杆菌及卡介苗(BCG)均存在共同抗原成分，从而导致该法用于结核病诊断特异性差。中国是结核病高度流行区，由于广泛接种BCG，也造成pro实验假阳性率很高，所以临床上只能根据pro实验皮肤的反应强弱给予辅助诊断。
[0004]细胞免疫介导的结核菌Y -干扰素(Y -1FN)释放试验是近年来采用酶联免疫吸附法(ELISA)或酶联免疫斑点法(ELISpot)，通过定量检测受检者外周血单个核细胞在结核分枝杆菌特异抗原刺激下释放的Y-1FN，从而对潜伏和活动性结核感染进行诊断。该方法原理为Thl型分泌因子Y-1FN与体内结核菌抗原含量密切相关。被结核分枝杆菌抗原致敏的T细胞再次遇到同类抗原时能产生高水平的Y -1FN,因此被用于结核感染的诊断。根据此原理，英国牛津免疫技术公司已研发出TSPOT-TB结核感染诊断试剂盒，该试剂盒应用结核菌特异性抗原早期抗原靶6 (ESAT-6)、培养滤液蛋白10 (CFP-10)刺激受检者外周血中单个核细胞，通过检测Y-1FN水平从而对结核感染进行诊断。该实验不受BCG及非结核分枝杆菌影响，且其检测灵敏度和特异性均高。遗憾的是，基于Y-干扰素释放试验的方法虽然能对结核分枝杆菌感染进行快速诊断，但该方法却不能用于区分活动性与潜伏性结核感染。
[0005]活动性结核患者应尽早给予治疗。然而，中国是结核病大国，存在大量的潜伏性结核感染者，这类潜伏性结核感染人群可能终生都没有临床症状，也不需要进行任何治疗。由于Y-干扰素释放试验的高灵敏性，除了活动性结核感染者之外，应用此方法检测潜伏性结核感染者也均为阳性，因此给临床用药带来困难。此也为Y-干扰素释放试验进行结核诊断在中国难以推广的重要原因。如果能开发出只有活动性结核患者才表现为阳性，而潜伏性结核患者表现为阴性的检测方法，将对我国结核病诊断及治疗具有重要意义。
[0006]目前，国内还未开发出用于活动性结核病诊断的同类产品。
【发明内容】
[0007]本发明所要解决的技术问题就是提供了一种基于抗原特异性TNF- a -ELISA检测活动性结核病的试剂盒及其应用，该试剂盒通过ELISA技术检测受检者外周血单个核细胞在不同刺激下分泌的TNF- α水平，从而计算抗原特异性TNF- α值。
[0008]为解决上述技术问题，本发明提供的一种基于TNF- a -ELISA检测活动性结核病的试剂盒，该试剂盒包括:
[0009]I)包被TNF- α抗体的酶标板；
[0010]2 ) TNF- α蛋白标准品；
[0011]3) ESAT-6 和 CFP-10 的蛋白液；
[0012]4 )生物素标记TNF- α抗体。
[0013]进一步地，所述试剂盒还包括PBS浓缩洗涤液、植物血凝素、底物液和终止液中任意一种或几种。
[0014]再进一步地，所述ESAT-6和CFP-10的蛋白液浓度均为10 μ g/ml。
[0015]再进一步地，所述试剂盒还包括亲和素标记的辣根过氧化物酶。
[0016]本发明还提供了所述的试剂盒在检测活动性结核病中的应用，包括以下步骤:
[0017]I)向收集得到的受检者外周血单个核细胞悬液中加入ESAT-6和CFP-10的蛋白液，进行诱导，阴性对照为向受检查者外周血单个核细胞的培养液中加入培养液进行诱导，用于检测本底TNF-α水平；
[0018]2)在37°C、5%C02的培养箱中培养16?20小时，收集培养液的上清；
[0019]3)采用ELISA技术检测培养液上清中各孔TNF- α浓度；
[0020]4)计算抗原特异性TNF- α值:外周血单个核细胞在结核分枝杆菌抗原ESAT-6和CFP-10刺激下分泌的TNF-α水平减去本底TNF-α水平；
[0021]5)根据抗原特异性TNF- α值大小判断患者是否存在活动性结核感染。
[0022].作为优选方案，试剂盒在检测活动性结核病中的应用，包括以下步骤:
[0023]I)在普通96孔反应板的四个孔内加入100 μ I待测的外周血单个核细胞悬液；
[0024]2)在上述四个孔中加入如下试剂:阴性对照孔加入50μ I培养液；阳性对照孔加Λ 50 μ I植物血凝素；两个检测孔分别加入50 μ I的ESAT-6蛋白液和50 μ I的CFP-10蛋白液；
[0025]3)将96孔板置于37°C、5%C02的培养箱中培养16?20小时；
[0026]4)取出步骤3)中的96孔板，收集各孔培养液上清；
[0027]5)将TNF-α蛋白标准品用PBS洗涤液溶解后进行倍比稀释:800pg/ml、400pg/ml、200pg/ml> 100pg/ml>50pg/ml 和 25pg/ml 六个浓度梯度；
[0028]6)分别取100 μ I步骤4)得到培养液上清和步骤5)得到六个浓度梯度的溶液，分别加入包被TNF-a抗体的酶标板的孔内，空白对照孔加入100μ I的PBS洗涤液；继续在以上各孔中分别加入50 μ I生物素标记TNF- α抗体；
[0029]7)将包被TNF- α抗体的酶标板置于37°C条件下孵育90分钟；
[0030]8)取出包被TNF- α抗体的酶标板，弃上清液，加入250?300 μ I的PBS洗涤液2?3次，最后一次将酶标板在滤纸上拍干；
[0031]9)向对应的酶标板孔内分别加入100 μ I的亲和素辣根过氧化物酶结合物；将酶标板置于37°C条件下孵育30分钟；
[0032]10)取出酶标板弃上清液，加入250?300 μ I的PBS洗涤液2?3次，最后一次将酶标板在滤纸上拍干；
[0033]11)向对应的酶标板孔内分别加入100 μ I的底物液，避光条件下室温孵育10?30分钟；
[0034]12)再向对应的酶标板孔内分别加入100 μ I的终止液，10分钟内通过酶标仪检测450nm处吸光值；
[0035]13)通过TNF-α标准品各浓度和吸光值绘制标准曲线，并将各检测样本吸光值通过标准曲线换算成各检测样本TNF-a浓度。
[0036]本发明原理:
[0037]本发明根据结核感染患者体内特异性效应细胞再次受到结核抗原诱导时可迅速活化，并大量分泌炎性细胞因子TNF-a (肿瘤坏死因子-a )，且结核特异性TNF-α分泌在潜伏和活动性结核感染患者中存在显著差异。所以，和Y-干扰素释放试验相比，针对检测抗原特异性TNF-a的方法，在区分潜伏性与活动性结核感染时具有优势。
[0038]本发明的有益效果在于:
[0039]本发明应用基于TNF-a -ELISA检测活动性结核病的试剂盒，可以建立一种区分活动性与潜伏性结核感染的方法，仅活动性结核患者表现为阳性，该方法通过ELISA技术定量检测结核特异性抗原ESAT-6和CFP-10刺激条件下外周血单个核细胞释放的TNF-a，以及非刺激情况下外周血单个核细胞释放的本底TNF-a，通过以上两者相减得到抗原特异性TNF- α值，从而对活动性结核病进行直接诊断。
[0040]本发明涉及的方法及试剂盒在区分潜伏性及活动性结核感染时具有良好的性能参数，诊断活动性结核感染敏感性达到80%，而应用该试剂盒检测潜伏性结核患者、非结核患者及健康对照者时，绝大部分均为阴性，说明该试剂盒同样具有良好的特异性。此外，本发明应用的是基于ELISA的方法原理，因此同时具有快速、经济等优点，以上说明本方法对结核病的早期诊断具有重要意义。
【专利附图】
【附图说明】
[0041]图1为TNF-a标准品各浓度和吸光值绘制标准曲线图；
[0042]图2为ESAT-6诱导的抗原特异性TNF- α值分布图；
[0043]图3为CFP-10诱导的抗原特异性TNF- α值分布图。
【具体实施方式】
[0044]为了更好地解释本发明，以下结合具体实施例进一步阐明本发明的主要内容，但本发明的内容不仅仅局限于以下实施例。[0045]实施例1
[0046]—种基于TNF- a -ELISA检测活动性结核病的试剂盒，该试剂盒包括:
[0047]I)包被TNF- α抗体的酶标板；
[0048]2 ) TNF- α蛋白标准品； [0049]3) ESAT-6 和 CFP-10 的蛋白液；
[0050]4)生物素标记TNF- α抗体；
[0051 ] 试剂盒还包括PBS浓缩洗涤液、植物血凝素、底物液和终止液中任意一种或几种。
[0052]试剂盒还包括亲和素标记的辣根过氧化物酶。
[0053]ESAT-6和CFP-10的蛋白液浓度均为10 μ g/ml。
[0054].试剂盒在检测活动性结核病中的应用，包括以下步骤:
[0055]I)在普通96孔反应板的四个孔内加入100 μ I待测的外周血单个核细胞悬液；
[0056]2)在上述四个孔中加入如下试剂:阴性对照孔加入50μ I培养液；阳性对照孔加Λ 50 μ I植物血凝素；两个检测孔分别加入50 μ I的ESAT-6蛋白液和50 μ I的CFP-10蛋白液；
[0057]3)将96孔板置于37°C、5%C02的培养箱中培养16~20小时；
[0058]4)取出步骤3)中的96孔板，收集各孔培养液上清；
[0059]5)将TNF-α蛋白标准品用PBS洗涤液溶解后进行倍比稀释:800pg/ml、400pg/ml、200pg/ml> 100pg/ml>50pg/ml 和 25pg/ml 六个浓度梯度；
[0060]6)分别取100 μ I步骤4)得到培养液上清和步骤5)得到六个浓度梯度的溶液，分别加入包被TNF- α抗体的酶标板的孔内，然后在空白对照孔加入100 μ I的PBS洗涤液；继续在以上各孔中分别加入50 μ I的生物素标记TNF-a抗体；
[0061]7)将包被TNF- α抗体的酶标板置于37°C条件下孵育90分钟；
[0062]8)取出包被TNF- α抗体的酶标板，弃上清液，加入250~300 μ I的PBS洗涤液2~3次，最后一次将酶标板在滤纸上拍干；
[0063]9)向对应的酶标板孔内分别加入100 μ I的亲和素辣根过氧化物酶结合物；将酶标板置于37°C条件下孵育30分钟；
[0064]10)取出酶标板弃上清液，加入250~300 μ I的PBS洗涤液2~3次，最后一次将酶标板在滤纸上拍干；
[0065]11)向对应的酶标板孔内分别加入100 μ I的底物液，避光条件下室温孵育10~30分钟；
[0066]12)再向对应的酶标板孔内分别加入100 μ I的终止液，10分钟内通过酶标仪检测450nm处吸光值；
[0067]13)通过TNF- α标准品各浓度和吸光值绘制标准曲线，并将各检测样本吸光值通过标准曲线换算成各检测样本TNF-α浓度；结果判定:
[0068]如果阳性对照孔TNF-α浓度> 100pg/ml，则标本符合要求。在标本符合要求的基础上，如果ESAT-6检测孔或CFP-10检测孔抗原特异性TNF- α值≥135pg/ml，则结果判定为阳性(活动性结核感染)；如果ESAT-6检测孔或CFP-10检测孔抗原特异性TNF- α值处于70~135pg/ml，则结果判定为可疑；如果ESAT-6检测孔和CFP-10检测孔抗原特异性TNF-a值< 70pg/ml，则结果判定为阴性(无活动性结核感染)。[0069]本发明的试剂盒中所用的物品(包被TNF- α抗体的酶标板、TNF- α蛋白标准品、生物素标记TNF- α抗体和亲和素标记的辣根过氧化物酶)都可以在市面上购买，直接使用。
[0070]在现实的检测过程，每一个酶标板都至少有一个阴性对照、一个阳性对照和一组标准曲线对应孔，以保证每一组实验的准确性。
[0071]实施例2
[0072]使用上述试剂盒和相对应的方法检测20例活动性结核患者、20例潜伏性结核对照者、10例非结核患者及10例健康对照者。
[0073]—病例选取
[0074]所有患者及对照者均来自华中科技大学同济医学院附属同济医院。四组人群的收录标准如下:
[0075]活动性结核患者:有发热、盗汗或消瘦等临床症状，且临床涂片或培养阳性。
[0076]潜伏性结核对照者:无发热、盗汗或消瘦等临床症状，无结核影像学表现，但结核感染T细胞检测(T-SPOT)阳性。
[0077]非结核患者:有发热、盗汗或消瘦等临床症状，但结核感染T细胞检测(T-SPOT)阴性。
[0078]健康对照者:无发热、盗汗或消瘦等临床症状，无结核影像学表现，且结核感染T细胞检测(T-SPOT)阴性。
[0079]二检测方法:
[0080]1、分离受检者外周血单个核细胞
[0081 ] I)抽取4?6ml血液加入无菌抗凝采血管中，采取血液后颠倒混匀，得到抗凝血；
[0082]2)取出一支15ml无菌离心管，加入4ml抗凝血和4ml无菌PBS，得到8ml血液稀释品，颠倒混勾;
[0083]3)另取一支15ml无菌离心管，加入4ml外周血单个核细胞分离液，然后在其上层小心加入8ml稀释血液,形成明显界面,室温条件下IOOOg离心25min ；
[0084]4)离心后可见一层明显的云雾状单个核细胞，将此层细胞吸取至另一无菌离心管中；
[0085]5)在装有单个核细胞的离心管中加入6_8ml无菌PBS，吹打混匀，室温条件下600g离心IOmin ；
[0086]6)弃上清，重复步骤(5);
[0087]7)弃上清，加入200 μ I含10%小牛血清的1640培养液重悬细胞，取10 μ I重悬后的细胞加入血球计数板中，在显微镜下计数，加入含10%小牛血清的1640培养液将细胞稀释至2.5 X IO6细胞/ml，待用；
[0088]2、细胞诱导
[0089]I)在普通96孔反应板的四个孔内加入100 μ I待测的外周血单个核细胞悬液(每个检测样本加四孔);
[0090]2)在上述四个孔中加入如下试剂:阴性对照孔加入50 μ I培养液(用于检测非刺激条件下的本底TNF-α水平)；阳性对照孔加入50 μ I植物血凝素(PHA);两个检测孔分别加入50 μ I的ESAT-6蛋白液和50 μ I的CFP-10蛋白液；
[0091]3)将96孔板置于37°C、5%C02的培养箱中培养16?20小时；[0092]3、检测
[0093]I)取出上述细胞诱导的步骤3)中的96孔板，收集各孔培养液上清；
[0094]2)将TNF-α蛋白标准品用PBS洗涤液溶解后进行倍比稀释:800pg/ml、400pg/ml、200pg/ml> 100pg/ml>50pg/ml 和 25pg/ml 六个浓度梯度；
[0095]3)分别取100μ I步骤I)得到培养液上清和步骤2)得到六个浓度梯度的溶液，分别加入包被TNF-a抗体的酶标板的孔内，空白对照孔加入100μ I的PBS洗涤液；继续在以上各孔中分别加入50 μ I的生物素标记TNF- α抗体；
[0096]4)将包被TNF- α抗体的酶标板置于37°C孵箱内孵育90分钟；
[0097]5)取出包被TNF- α抗体的酶标板，弃上清液，加入250?300 μ I的PBS洗涤液2?3次，最后一次将酶标板在滤纸上拍干；
[0098]6)向对应的酶标板孔内分别加入100 μ I的亲和素辣根过氧化物酶结合物；将酶标板置于37°C孵箱内孵育30分钟；
[0099]7)取出酶标板弃上清液，加入250?300 μ I的PBS洗涤液2?3次，最后一次将酶标板在滤纸上拍干；
[0100]8)向对应的酶标板孔内分别加入100 μ I的底物液，避光条件下室温孵育10?30分钟；
[0101]9)再向对应的酶标板孔内分别加入100 μ I的终止液，10分钟内通过酶标仪检测450nm处吸光值；
[0102]10)通过TNF- α标准品各浓度和吸光值绘制标准曲线，并分别将所有患者及对照者4个检测孔吸光值通过标准曲线换算成各检测样本TNF- α浓度；
[0103]标准品浓度及吸光度结果如下:
[0104]
25pg/ml0.0650pg/ml0.105I OOp g/ml0.178200pg/ml0.34400pg/ml0.618800pg/ml1.395
[0105]根据标准品浓度及吸光度结果绘制标准曲线如图1:
[0106]根据图1显示的标准曲线换算出所有受检者ESAT-6检测孔和CFP-10检测孔TNF-a浓度，以及阴性对照孔即本底TNF-a浓度，使用以上两者相减计算出每个样本ESAT-6刺激和CFP-10刺激的抗原特异性TNF- α值。
[0107]4、实验结果:
[0108]四组受检者ESAT-6刺激下的抗原特异性TNF- α值和CFP-10刺激下的抗原特异性TNF- α值分别表示如下图2和图3所示:
[0109]根据以下结果判断原则:如果ESAT-6检测孔或CFP-10检测孔抗原特异性TNF- a值> 135pg/ml，则结果判定为阳性(活动性结核感染)；如果ESAT-6检测孔或CFP-10检测孔抗原特异性TNF-α值处于70?135pg/ml，则结果判定为可疑；如果ESAT-6检测孔和CFP-10检测孔抗原特异性TNF- α值< 70pg/ml，则结果判定为阴性(无活动性结核感染)。
[0110]入选的20例活动性结核患者中，抗原特异性TNF- α值(ESAT-6检测孔或CFP-10检测孔TNF-α浓度减去阴性对照孔TNF-α浓度)大于135pg/ml的有16例，使用本方法检测的敏感性达到80% ；
[0111]入选的20例潜伏性结核对照中，18例抗原特异性TNF-α值均小于135pg/ml，仅有2例结果大于135pg/ml，判断为阳性；
[0112]入选的10例健康对照中，抗原特异性TNF-α值均小于70pg/ml ；
[0113]入选的10例非结核对照中，抗原特异性TNF-a值小于70pg/ml的有8例，I例为可疑，I例为阳性。
[0114]以上结果表明，使用本发明检测活动性结核感染具有较高的敏感性及特异性，且实验操作简单，24小时即可报告结果，说明本发明的试剂盒可以作为辅助诊断活动性结核病的一种手段。
[0115]其它未详细说明的部分均为现有技术。尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。
【权利要求】
1.一种基于抗原特异性TNF-a-ELISA检测活动性结核病的试剂盒，其特征在于:该试剂盒包括:1)包被TNF-α抗体的酶标板；2)TNF-α蛋白标准品；3)ESAT-6和CFP-10的蛋白液；4)生物素标记的TNF-α抗体。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于:所述试剂盒还包括浓缩PBS洗涤液、植物血凝素、底物液和终止液中任意一种或几种。
3.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于:所述ESAT-6和CFP-10的蛋白液浓度均为10 μ g/mlo
4.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于:所述亲和性的标记物为辣根过氧化物酶。
5.权利要求1~4任意一项所述的试剂盒在检测活动性结核病中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于:包括以下步骤:O向收集得到的受检者外周血单个核细胞悬液中加入ESAT-6和CFP-10的蛋白液，进行诱导，阴性对照为向受检查者外周血单个核细胞的培养液中加入培养液进行诱导；2)在37°C、5%C02的培养箱中培养16~20小时，收集培养液的上清；3)采用ELISA技术检测培养液上清中各孔TNF-α浓度；4)计算抗原特异性TNF-α值:外周血单个核细胞在结核分枝杆菌抗原ESAT-6和CFP-10刺激下分泌的TNF-α水平减去本底TNF-α水平；5)根据抗原特异性TNF-α值大小判断患者是否存在活动性结核感染。
7.根据权利要求5或6所述的应用，其特征在于:包括以下步骤:.1)在普通96孔反应板的四个孔内加入100μ I待测的外周血单个核细胞悬液；.2)在上述四个孔中加入如下试剂:阴性对照孔加入50μ I培养液；阳性对照孔加入.50 μ I植物血凝素；两个检测孔分别加入50 μ I的ESAT-6蛋白液和50 μ I的CFP-10蛋白液；.3)将96孔板置于37°C、5%C02的培养箱中培养16~20小时；.4)取出步骤3)中的96孔板，收集各孔培养液上清；.5)将TNF-α蛋白标准品用PBS洗涤液溶解后进行倍比稀释:800pg/ml、400pg/ml、200pg/ml> 100pg/ml>50pg/ml 和 25pg/ml 六个浓度梯度；.6)分别取100μ I步骤4)得到培养液上清和步骤5)得到六个浓度梯度的溶液，分别加入包被TNF- α抗体的酶标板的孔内，然后在空白对照孔加入100 μ I的PBS洗涤液；继续在以上各孔中分别加入50 μ I的生物素标记TNF- α抗体；.7)将包被TNF-α抗体的酶标板置于37°C条件下孵育90分钟；.8)取出包被TNF-α抗体的酶标板，弃上清液，加入250~300 μ I的PBS洗涤液2~3次，最后一次将酶标板在滤纸上拍干；.9)向对应的酶标板孔内分别加入100μ I的亲和素辣根过氧化物酶结合物；将酶标板置于37°C条件下孵育30分钟；.10)取出酶标板弃上清液，加入250~300μ I的PBS洗涤液2~3次，最后一次将酶标板在滤纸上拍干；11)向对应的酶标板孔内分别加入100μ l的底物液，避光条件下室温孵育10~30分钟；12)再向对应的酶标板孔内分别加入100μ l的终止液，10分钟内通过酶标仪检测450nm处吸光值；13)通过TNF-α标准品各浓度和吸光值绘制标准曲线，并将各检测样本吸光值通过标准曲线换算成各检测样本TNF-α浓度；结果判定。
【文档编号】G01N33/68GK103604933SQ201310616043
【公开日】2014年2月26日 申请日期:2013年11月27日 优先权日:2013年11月27日
【发明者】孙自镛, 汪峰, 侯红艳 申请人:华中科技大学同济医学院附属同济医院