一种纳米探针诱导酶聚合放大电化学核酸适体传感器检测癌胚抗原的方法与流程

本发明属于电化学生物传感器研究领域，涉及一种纳米探针诱导酶聚合放大电化学核酸适体传感器检测癌胚抗原的方法。

背景技术：

一方面癌胚抗原是一种广谱性的肿瘤标记物，在多种肿瘤的疗效判断、病情发展、监测和预后估计中有着重要的作用；另一方面，实际样本中的癌胚抗原含量往往很低，需要研究和设计高灵敏度和高选择性的检测方法来实现癌胚抗原的检测。为了提高癌胚抗原的检测灵敏度和选择性，各种癌胚抗原检测方法也应运而生，在各种检测方法中实现癌胚抗原的特异性识别和信号放大成为研究的重点。

在蛋白质的检测中，最常用的识别分子是抗体。但是抗体的制备过程复杂、制备费用高，而且抗体分子要在一定的条件下才能保持活性，影响着检测方法的灵敏度和适用范围。为了解决这一难题，最近几十年出现了一种新的识别分子——核酸适体。核酸适体是一种能够特异性识别靶分子的寡聚核苷酸片段，对可结合的靶分子有严格的识别能力和高度的亲和性，并且其制备过程简单、制备费用较低、存储和使用条件没有抗体严格。核酸适体自被发现以来得到大家广泛研究和应用。

在信号放大过程中常用的有核酸扩增技术，纳米材料和酶等。目前常用的核酸扩增技术有聚合酶链式反应和一些等温核酸扩增技术如滚环复制扩增等。聚合酶链式反应技术需要严格控制温度的变化，因而需要比价复杂的反应仪器，成本较高；而滚环复制扩增过程也需要加入反应模版，从而增加了反应体系的复杂程度，增加了成本。为了解决这些问题，一种新的核酸扩增技术表面诱导末端延伸技术应运而生，这种在末端脱氧核糖核酸转移酶催化的无需模版的在核酸3’末端延伸核酸长链的核酸放大技术得到了广泛的应用。纳米材料因为其特有的尺寸性质，在信号放大策略中得到发挥着不可替代的作用。而金纳米粒子有高的表面体积比、制备工艺较成熟、稳定性好、生物相容性好，易于功能化(特别是可以通过金-硫键将核酸修饰在金纳米粒子表面)等优点。酶催化作用能够在引入一个酶分子的情况下催化多个底物的反应而使信号得到放大，也在信号放大策略中扮演着不可忽视的角色。

技术实现要素：

本发明的目的是为了高灵敏和高选择性地检测痕量的癌胚抗原，提供一种纳米探针诱导酶聚合放大的电化学核酸适体传感器检测癌胚抗原的方法。

实现本发明目的的技术解决方案为：一种纳米探针诱导酶聚合放大的电化学核酸适体传感器检测癌胚抗原的方法，包括如下步骤：

步骤一、纳米探针的制备：在金纳米粒子溶液中缓慢加入5’末端巯基标记癌胚抗原核酸适体信号探针溶液，反应后陈化，然后离心、洗涤、离心、重悬；

步骤二、电化学传感器的制备：(a)金电极的清洗：以NaBH₄溶液浸泡后打磨，然后超声清洗；(b)自清洁表面的制备：室温下在金电极表面自组装3’末端标记巯基的癌胚抗原核酸适体捕获探针溶液，然后用OEG室温下浸泡封闭，得到自清洁表面；(c)纳米探针的修饰：在自清洁表面滴加癌胚抗原溶液反应不少于1小时，滴加纳米探针溶液反应不少于1小时；(d)末端延伸：在末端脱氧核糖核酸转移酶的作用下，在步骤(c)修饰到金电极表面的5’端巯基标记癌胚抗原核酸适体信号探针的3’端延伸生物素标记的核酸长链，加入亲和素标记的辣根过氧化物酶反应不少于15min，通过生物素-亲和素相互作用，在电极表面修饰辣根过氧化物酶，制得电化学传感器；

步骤三、电化学信号检测：将制备完成的电化学传感器放在三电极体系中以循环伏安法和时间电流曲线法进行检测，得到电化学信号。

步骤一中，采用的重悬溶剂为含有1wt％吐温的PBS溶液，其中金纳米粒子的粒径为30nm，其溶液浓度为1nmol/L；5’末端巯基标记癌胚抗原核酸适体信号探针的溶液浓度为0.5-15μmol/L。

步骤二(b)中，3’端巯基标记癌胚抗原捕获探针的浓度为0.5-5μmol/L，自组装时间不小于4小时；HS-(CH₂)₁₁-EG2-OH(OEG)浓度为0.5-2.5mmol/L，浸泡时间不小于4小时。

步骤二(d)中，末端脱氧核糖核酸转移酶的浓度为1U，生物素标记的核苷酸为生物素标记的腺嘌呤脱氧核糖核苷酸，浓度为5.7μmol/L，延伸时间不小于1小时。

步骤三中，电化学检测体系为三电极体系，工作电极为金电极，参比电极为Ag/AgCl 电极，对电极为铂丝电极，其中，电解液为3,3',5,5'-四甲基联苯胺溶液(TMB)，循环伏安法扫描高电位为0.7V，低电位为0V，扫描速度为0.1V/s；时间电流曲线法的扫描电位为0.1V，扫描时间为100s。

步骤一和二中，所述核酸适体序列如下：所述的5’末端巯基标记癌胚抗原核酸适体信号探针序列为：5’-SH-TTT TTT TTT TCC CAT AGG GAA GTG GGG GA-3’；所述的3’末端巯基标记癌胚抗原核酸适体捕获探针序列为：5’-TTA ACT TAT TCG ACC ATA TTT TTT TTT T-SH-3’。

本发明与现有技术相比，具有以下特点：

1、检测灵敏度高：本发明对癌胚抗原的检测下限低于10fg/ml，在现有的癌胚抗原检测传感器中处于较高的灵敏度水平。

2、检测的范围宽：本发明对DNA的检测范围宽度大于8个数量级，在现有的癌胚抗原传感器中处于较宽的检测宽度。

3、检测体系简单：本发明使用的检测方法为简单的电化学检测，对样本的颜色没有要求，灵敏度高，并且易于简单化和微型化。

4、实际应用性强：本发明的癌胚抗原传感器在模拟的血清样本中仍然具有较高的检测信号，说明本传感器在实际样本中的应用性强，有很高的临床诊断方面应用前景。

附图说明

图1是本发明纳米探针诱导的酶聚合放大电化学核酸适体传感器检测癌胚抗原方法的过程示意图。

图2是本发明实施例1的纳米探针吸光度曲线，其中，A中a为未修饰5’端巯基标记癌胚抗原核酸适体信号探针的吸光度曲线，b为修饰5’端巯基标记癌胚抗原核酸适体信号探针的吸光度曲线；B中，c为纳米金加了氯化钠后的吸光度曲线，d为纳米探针加氯化钠的吸光度曲线。

图3是本发明实施例2-4中的条件优化结果图，其中A为实施例2，B为实施例3，C为实施例4。

图4是本发明实施例5中的对不同浓度癌胚抗原的检测电流图。

图5是本发明实施例6中的相同浓度下前列腺特异性抗原、小牛血清白蛋白和癌胚抗原的检测电流对比图。

图6是本发明实施例7中在缓冲溶液和血清中相同浓度癌胚抗原检测电流对比图。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明作进一步的说明，其目的是为了更好理解本发明的内容，但所举的实施例并不限制本发明的保护范围：

如附图1中所示的步骤，搭建纳米探针诱导酶聚合放大电化学核酸适体传感器体系，并进行电化学检测。

(1)电化学传感器检测癌胚抗原体系的建立

a、金电极清洗：1)NaBH₄溶液浸泡(往NaBH₄固体中先加入一定体积的无水乙醇，再加入等体积的双蒸水，混匀后将电极浸泡在其中，浸泡15分钟，用双蒸水冲洗掉NaBH₄溶液)2)打磨(在磨布上倒上一定量的Al₂O₃粉末，然后加上少量水，将电极垂直在磨布上打磨3分钟，用超纯水冲洗干净)3)超声清洗(先用乙醇超声清洗4-5分钟，再用双蒸水超声清洗4-5分钟，用双蒸水冲洗)4)电化学扫描(以0.5mol/L的H₂SO₄为电解液，Ag/AgCl电极作为参比电极，铂丝电极作为对电极，对金工作电极进行电化学扫描。先进行慢扫，然后加2V电压电解5秒，再加-0.35V电压电解10秒，而后快速扫描2次，清洗电极并且换H₂SO₄后慢扫1次，观察扫描的循环伏安图，若最后一次慢扫得到的两条曲线完全重合，并且氧化峰有四个，还原电流是最低电流的40倍，则判断电极清洗干净)清洗干净的电极用N₂吹干，没有洗干净的电极则需要重复清洗步骤。

b、自清洁表面制备：1)以5×PBS稀释3’末端巯基标记的癌胚抗原核酸适体捕获探针至所需浓度得到组装液，在清洗干净并用N₂吹干的电极表面滴加3μL组装液，使组装液覆盖在金电极表面，确保组装液与金电极表面完全接触，且液滴中不含有气泡，在电极上加盖1.5ml离心管以减少反应过程中组装液的蒸发且避免杂质进入组装液，在室温下反应4小时以上。2)以无水乙醇稀释OEG至所需浓度，分装在2 ml离心管中，100μL/管，将组装好的电极用PBS溶液冲洗10秒，并用N₂吹干，然后将电极表面浸泡在制备好的封闭液中，确保电极表面与封闭液完全接触没有气泡，用密封膜缠好离心管与电极，减少封闭液的蒸发，室温下反应4h以上。

c、癌胚抗原免疫结合：以PBS稀释癌胚抗原溶液至所需浓度得到杂交液，将OEG处理后的电极用PBS冲洗10秒，且用N₂吹干，然后将稀释的杂交液滴加3μL在干燥的电极表面，在电极上加盖1.5ml离心管，在反应过程中减少组装液的蒸发且避免杂质进入组装液，在室温下反应1小时。

d、信号探针的修饰：将免疫结合后的电极用PBS溶液冲洗10秒，并且用N₂吹干，吹干后的电极表面滴加3μL纳米探针溶液，加盖1.5ml离心管后，室温下反应1小时。

e、末端延伸：将免疫结合后的电极用PBS溶液冲洗10秒，并且用N₂吹干，吹干后的电极表面滴加3μL末端延伸液(末端脱氧核糖核酸转移酶的浓度为1U，底物为浓度5.7μmol/L的生物素标记腺嘌呤脱氧核糖核苷酸)，加盖1.5ml离心管后，室温下反应1小时。确保延伸液与金电极表面完全接触。

f、辣根过氧化物酶标记：将延伸后的电极用PBS溶液冲洗，并且用N₂吹干，吹干后的电极表面滴加3μL生物素标记辣根过氧化物酶溶液，加盖1.5ml离心管后，室温下反应15分钟。

(2)电化学信号的检测

将标记好辣根过氧化物酶的电极用PBS溶液冲洗，以市售3,3',5,5'-四甲基联苯胺溶液(TMB)为电解液，用三电极体系进行检测，参比电极为Ag/AgCl电极，对电极为铂电极。循环伏安图的高电位为0.7V，低电位为0V，扫描速度为0.1V/s；时间电流曲线的实验电位为0.1V，试验时间为100秒。

实施例1：纳米探针的制备

采用本发明所述的纳米探针诱导酶聚合放大电化学核酸适体传感器检测癌胚抗原的方法，首先要制备纳米探针。纳米探针制备步骤如下：将1000mL的金纳米粒子溶液离心浓缩至300μL，其终浓度约为1nmol/L；缓慢加入不同体积的浓度为100μmol/L的5’末端巯基标记的癌胚抗原核酸适体信号探针溶液，；以350rpm转速振 荡反应16小时后加入等体积0.02mol/L PBS(PH＝7，0.2mol/L NaCl)，陈化40小时；以10000rpm转速离心15分钟，加入0.01mol/L PBS(PH＝7，0.1mol/L NaCl)，10000rpm转速离心15分钟，以含1wt％吐温的PBS(0.01M，0.25M NaCl)溶液重悬，制得纳米探针溶液。对制备的纳米探针溶液进行紫外检测，考察其粒径变化，其结果如图2A所示，a为未修饰5’端巯基标记癌胚抗原核酸适体信号探针的吸光度曲线，b为修饰5’端巯基标记癌胚抗原核酸适体信号探针后的吸光度曲线，表明在修饰5’端巯基标记癌胚抗原核酸适体信号探针前后金纳米粒子的粒径没有发生很大的变化，也即在修饰过程中很好地控制了团聚现象；对制备的纳米探针溶液进行稳定性考察，结果如图2B所示，在加入0.5mmol/L氯化钠之后，c为未修饰的金纳米粒子溶液由红色变为紫色，650nm处的吸光度增强，d为纳米探针溶液保持红色不变，吸光度曲线没有变化，说明纳米探针溶液在高盐溶液中有更好的稳定性，也说明了纳米探针溶液的制备是成功的。

实施例2：5’端巯基标记癌胚抗原核酸适体信号探针浓度对电化学信号检测结果的影响。

采用本发明所述的纳米探针诱导酶聚合放大电化学核酸适体传感器检测癌胚抗原的方法，以癌胚抗原溶液为目标物，搭建纳米探针诱导酶聚合放大电化学核酸适体传感器体系，所有操作步骤如上所述，其中组装的3’端巯基标记癌胚抗原核酸适体捕获探针浓度为3μmol/L，封闭液OEG的浓度为1mmol/L，癌胚抗原的浓度为1μg/mL，纳米探针采用实施例1中所述的纳米探针制备步骤，其中加入的5’端巯基标记癌胚抗原核酸适体信号探针的终浓度为0.6、1.5、3、6和15μmol/L，制备得到一系列的纳米探针溶液，分析不同的5’端巯基标记癌胚抗原核酸适体信号探针浓度对检测电化学信号的影响，其分析结果如附图3A所示，5’端巯基标记癌胚抗原核酸适体信号探针浓度低于3μmol/L，随着浓度的增加信噪比增强，高于3μmol/L，随着浓度的增加信噪比减弱，因此5’端巯基标记癌胚抗原核酸适体信号探针的较优浓度为3μmol/L。

实施例3：3’端巯基标记癌胚抗原核酸适体捕获探针组装密度对电化学信号检测结果的影响。

采用本发明所述的纳米探针诱导酶聚合放大电化学核酸适体传感器检测癌胚抗 原的方法，以癌胚抗原溶液为目标物，所有操作步骤实施例2所述，其中封闭液OEG的浓度为1mmol/L，癌胚抗原的浓度为1μg/mL，纳米探针采用实施例1中所述的纳米探针制备步骤，其中加入的5’端巯基标记癌胚抗原核酸适体信号探针的终浓度为3μmol/L，组装的3’端巯基标记癌胚抗原核酸适体捕获探针浓度为0.5、1、2、3和5μmol/L，分析不同的组装密度对检测电化学信号的影响，其分析结果如附图3B所示，3’端巯基标记癌胚抗原核酸适体捕获探针浓度低于3μmol/L，随着浓度的增加信噪比增强，高于3μmol/L，随着浓度的增加信噪比减弱，因此3’端巯基标记癌胚抗原核酸适体捕获探针的较优浓度为3μmol/L。

实施例4：OEG封闭浓度对电化学检测结果的影响。

采用本发明所述的纳米探针诱导酶聚合放大电化学核酸适体传感器检测癌胚抗原的方法，以癌胚抗原溶液为目标物，所有操作步骤如实施例2所述，其中组装的3’端巯基标记癌胚抗原核酸适体捕获探针浓度为3μmol/L，癌胚抗原的浓度为1μg/mL，纳米探针采用实施例1中所述的纳米探针制备步骤，其中加入的5’端巯基标记癌胚抗原核酸适体信号探针的终浓度为3μmol/L，封闭液OEG的浓度为0.5、1、1.5和2mmol/L，分析不同的封闭浓度对检测电化学信号的影响，其分析结果如附图3C所示，OEG浓度低于1mmol/L，随着浓度的增加信噪比增强，高于1mmol/L，随着浓度的增加信噪比减弱，因此OEG的较优浓度为1mmol/L。

实施例5：纳米探针诱导酶聚合放大电化学核酸适体传感器检测癌胚抗原的方法对不同浓度癌胚抗原的检测特性。

采用本发明所述的纳米探针诱导酶聚合放大电化学核酸适体传感器检测癌胚抗原的方法，以癌胚抗原溶液为目标物，所有操作步骤如实施例所述，其中组装的3’端巯基标记癌胚抗原核酸适体捕获探针浓度为3μmol/L，封闭液OEG的浓度为1mmol/L癌胚抗原的浓度为100fg/mL、1pg/mL、10pg/mL、100pg/mL、1ng/mL、10ng/mL、100ng/mL和1μg/mL，纳米探针采用实施例1中所述的纳米探针制备步骤，其中加入的5’端巯基标记癌胚抗原核酸适体信号探针的终浓度为3μmol/L，分析不同浓度癌胚抗原的电化学信号响应特性，分析结果如图4所示，在该检测范围内，电化学信号随癌胚抗原浓度的增加而升高，检测限低于100fg/mL。

实施例6：纳米探针诱导酶聚合放大电化学核酸适体传感器检测癌胚抗原的方法 对PBS溶液、前列腺特异性抗原、小牛血清白蛋白、癌胚抗原电化学信号对比。

采用本发明所述的纳米探针诱导酶聚合放大电化学核酸适体传感器检测癌胚抗原的方法，所有操作步骤如实施例2所述，其中组装的3’端巯基标记癌胚抗原核酸适体捕获探针浓度为3μmol/L，封闭液OEG的浓度为1mmol/L待测目标的浓度为1μg/mL，其中目标物为PBS溶液、前列腺特异性抗原溶液、小牛血清白蛋白溶液和癌胚抗原溶液，分析结果如图5所示由图可知，本发明的电化学传感器检测癌胚抗原的方法特异性强。

实施例7：纳米探针诱导酶聚合放大电化学核酸适体传感器检测癌胚抗原的方法对缓冲液及血清中癌胚抗原的电化学信号对比。

采用本发明所述的纳米探针诱导酶聚合放大电化学核酸适体传感器检测癌胚抗原的方法，以癌胚抗原溶液为目标物，所有操作步骤如实施例2所述，其中组装的3’端巯基标记癌胚抗原核酸适体捕获探针浓度为3μmol/L，封闭液OEG的浓度为1mmol/L待测目标物的浓度为0、10和100pg/mL，其中目标物的缓冲液为PBS溶液和血清，分析结果如图6所示，由图可知，本发明的电化学传感器检测癌胚抗原的方法能有实现血清样本中的癌胚抗原检测，显示了很好的实际运用前景。