一种检测牙周病相关蛋白的抗体芯片试剂盒的制作方法

本发明涉及生物检测
技术领域：
，具体地，涉及一种检测牙周病相关蛋白的抗体芯片试剂盒。
背景技术：
：牙周病是指发生在牙支持组织(牙周组织)的疾病，包括仅累及牙龈组织的牙龈病和波及深层牙周组织(牙周膜、牙槽骨、牙骨质)的牙周炎两大类。牙周疾病是常见的口腔疾病，是引起成年人牙齿丧失的主要原因之一，也是危害人类牙齿和全身健康的主要口腔疾病。牙周病的早期症状不易引起重视，造成牙周组织长期慢性感染，炎症反复发作，不仅损害口腔咀嚼系统的功能，还会严重影响健康。牙周病是从简单的牙龈发炎到软组组和牙齿骨组织损害的疾病，在最坏的情况下会导致牙齿的脱落。因此牙周炎的早期诊断和预防至关重要。目前包括牙周袋探诊，牙菌斑和x光片影像学诊断在内的临床检测可作为牙周病症状的指标，但这些检测不能指示疾病的发展情况。因此有必要开发一种新的检测方法反映疾病的状况，有效地预防和监测疾病的发生。龈沟液(gcf)是指通过沟内上皮和结合上皮从牙龈结缔组织渗入到龈沟内的液体。牙龈健康者有极少量龈沟液，由组织内的渗透梯度而使组织液渗入龈沟内。因为龈沟液中通常有炎症细胞，其他化学成分与组织液也不完全相同；龈沟液的流出量与该部位的炎症程度成正比。龈沟液的液体成分主要来源于血清，其他成分则分别来自血清、邻近的牙周组织及细菌。龈沟液包括各种电解质、蛋白质、葡萄糖、酶等，也含有白细胞、脱落的上皮细胞等，还有细菌及其他微生物。龈沟液中含有多种酶，其中天冬氨酸转氨酶、碱性磷酸酶、胶原酶等与牙周病的严重程度和活动期有一定关系。龈沟液量增多是牙龈炎早期的主要表现之一，常早于临床表征的改变。牙龈炎症明显时，龈沟液明显增多。龈沟液可以通过无创手段如试纸条进行采集检测，因此龈沟液中的蛋白可作为理想的标志物用于疾病的检测。牙周病相关蛋白包括炎症细胞因子(例如il-1β，il-6，il-8，il-10，il-12，ifng，tnfa和crp)，骨代谢相关的细胞因子(例如，opg，opn，rank，rankl和)和酶(例如碱性磷酸酶和天冬氨酸转氨酶)。检测牙周病的常用方法包括通过测量牙周袋的探诊深度、诊察附着在牙槽骨上的牙齿的x光照片并参考探诊出血。上述方法各有优缺点，在实际应用中，根据各自的实验目的和实验室条件进行选择。这些方法严重依赖于牙科医生的主观鉴定。探诊深度仅仅是对过去的附着丧失的测量，其在现在发生的牙周炎或其未来的发展中帮助很小。探诊出血能够表明复原过程而不是破坏过程。最近，虽然也开发了许多评估牙周病活动性的方法。然而，上述方法中没有一种提供了足够灵敏和特异的试验以诊断牙周炎及其破坏模式。非特异性方法的一个结果是几个实际没有患牙周炎的患者将被治疗。临床观察例如探诊深度不够可靠，因为深的牙周袋不是必然包含正在发生的炎症，x光线照相术评估必须结合详细的临床观察以给出正确的诊断，仅仅是在牙周袋中存在病原菌不能准确地反映疾病活动性。而且迄今为止开发的基于检测宿主或细菌来源蛋白质的酶学方法的诊断还不够特异的，因为免疫学检测法比较简单，迅速，重复性好，但假阳性率高，每次只能检测一个相关蛋白。有鉴于此，有必要开发一种新型的牙周病相关蛋白检测试剂盒，以克服现有技术中亟待解决的问题，实现多种目标蛋白的高通量、高灵敏度、高特异性和低成本检测。技术实现要素：本发明的目的是为了克服现有技术的不足，提供一种检测牙周病相关蛋白的抗体芯片试剂盒，该试剂盒能同时检测多个牙周病相关蛋白，克服了现有技术操作繁琐、检测指标单一、灵敏度低等缺陷，具有廉价、便利、灵敏、准确、高通量、标本用量少、能在普通实验室推广和规模化等优点。。为了实现上述目的，本发明是通过以下技术方案予以实现的：一种检测牙周病相关蛋白的抗体芯片试剂盒，包括抗体芯片，牙周病相关蛋白标准品混合物，生物素标记的牙周病相关蛋白检测抗体混合物；和荧光素cy3标记的链霉亲和素；其中，所述抗体芯片以含有烷基糖苷的亲水试剂处理的玻片作为固相载体，且多种牙周病相关蛋白的特异性抗体混合物在22～24℃、30～40％的湿度条件下点样到固相载体上。以没有空间限制的标准组织玻片作为载体，可使点在同一微阵列上检测细胞粘附因子的数目不受空间的限制，另外，玻片具有非常低的自身荧光，而且荧光信号不具扩散性，不同点间的荧光信号不会彼此干扰，所以一次可以同时检测多个细胞粘附因子。但是，以不同的方法来处理标准组织玻片，会影响玻片的背景、检测灵敏度，本发明通过比较多种处理玻片的方法，发现以亲水试剂烷基糖苷处理的玻片背景低，检测灵敏度高，实现了不仅一次可以检测十几个细胞粘附因子，并且所检测的细胞粘附因子灵敏度可达单因子的elisa检测灵敏度。优选地，所述牙周病相关蛋白检测抗体混合物为c反应蛋白、干扰素γ、白细胞介素-1α、白细胞介素-1β、白细胞介素-2、白细胞介素-4、白细胞介素-6、白细胞介素-8、白细胞介素-10、白细胞介素-12、白细胞介素-17、巨噬细胞炎性蛋白-1α、基质金属蛋白酶9、基质金属蛋白酶13、骨保护素、骨桥蛋白、骨活素、肿瘤坏死相关蛋白、肿瘤坏死因子β1、肿瘤坏死因子α的特异性抗体的混合物。更优选地，所述亲水试剂为质量分数为0.01～0.2％的烷基糖苷、0.01～0.1％的甘油，0.01～0.05％的聚乙二醇4000的超纯水溶液；亲水试剂处理玻片的方法为将玻片在亲水试剂中浸泡3～5分钟，晾干即可。最优选地，所述亲水试剂为质量分数为0.1％的烷基糖苷、0.05％的甘油，0.01％的聚乙二醇4000的超纯水溶液；亲水试剂处理玻片的方法为将玻片在亲水试剂中浸泡3分钟，晾干即可。优选地，所述牙周病相关蛋白检测抗体混合物在22℃、30％的湿度条件下点样到固相载体上。与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：以不同的方法来处理标准组织玻片，会影响玻片的背景、检测灵敏度，本发明通过比较多种处理玻片的方法，发现以含有烷基糖苷的亲水试剂处理的玻片背景低，检测灵敏度高，实现了不仅一次可以检测十几个牙周病相关蛋白，并且所检测的牙周病相关蛋白的灵敏度可达单个蛋白的elisa检测灵敏度。本发明的抗体芯片试剂盒克服了现有技术操作繁琐、检测指标单一、灵敏度低等缺陷，具有廉价、便利、灵敏、准确、高通量、标本用量少、能在普通实验室推广和规模化等优点。本发明的抗体芯片试剂盒尤其适用于c反应蛋白、干扰素γ、白细胞介素-1α、白细胞介素-1β、白细胞介素-2、白细胞介素-4、白细胞介素-6、白细胞介素-8、白细胞介素-10、白细胞介素-12、白细胞介素-17、巨噬细胞炎性蛋白-1α、基质金属蛋白酶9、基质金属蛋白酶13、骨保护素、骨桥蛋白、骨活素、肿瘤坏死相关蛋白、肿瘤坏死因子β1、肿瘤坏死因子α，这20种牙周病相关蛋白的特异性抗体的组合方式。因为，不同的牙周病相关蛋白的特异性抗体在本发明所述芯片检测系统中的灵敏性是不同的，所以，如果将一些低灵敏性的牙周病相关蛋白抗体与一些高灵敏性的牙周病相关蛋白抗体组合，会造成低灵敏性的牙周病相关蛋白的漏检。附图说明图1为抗体芯片点阵图。图2为牙周病相关蛋白的标准曲线图。具体实施方式下面结合说明书附图和具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。实施例1抗体芯片载体的筛选：常规的抗体芯片多以硝酸纤维素膜为载体，由于硝酸纤维素膜是多层结构，芯片的洗涤难度大，以致芯片的背景高，结果波动大。同时硝酸纤维素膜易碎，不易于大规模的操作，用于大规模临床样本的使用还不普遍。而传统的玻片价廉背景低，这给诊断和研究领域的广泛使用带来了突破。我们筛选了市面上不用活性方法处理的玻片，无论是醛基化还氨基化的玻片点样效果都不稳定。经过大量的筛查得出温度及玻片表面的活性试剂成分才是决定玻片点样效果的关键。采用以下5组的玻片：第1组为氨基化玻片，购自康宁公司，货号为ultragaps40019；第2组为醛基化玻片：将第1组玻片加入戊二醛浸泡40分钟制作醛基化玻片；第3组为apes玻片：将普通玻片加入丙酮稀释的apes中浸泡0.5～1分钟，再用纯丙酮清洗制成apes玻片；第4组为多聚赖氨酸玻片：将普通玻片加入pbs稀释的多聚赖氨酸浸泡0.5～1个小时，再用纯水清洗制成多聚赖氨酸玻片；第5组为经亲水试剂处理的玻片：将普通玻片用亲水试剂浸泡3～5分钟，室温晾干即可；所述亲水试剂为质量分数为0.01～0.2％的烷基糖苷、0.01～0.1％的甘油，0.01～0.05％的聚乙二醇4000的超纯水溶液。优选地，所述亲水试剂为质量分数为0.1％的烷基糖苷、0.05％的甘油，0.01％的聚乙二醇4000的超纯水溶液；亲水试剂处理玻片的方法为将玻片在亲水试剂中浸泡3分钟，晾干即可。各种玻片的点样效果不尽相同，加入亲水涂层的玻片点样效果较明显，点样效果较未处理过的高。其中经过氨基化及亲水处理的玻片较其他的类型效果较高。在22～24℃条件下，膜/玻片点样效果较清晰，背景值低；而在27～30℃条件下，无论何种膜/玻片的点样效果都出现扩散现象，温度湿度越高，扩散越明显。上述5组玻片结合抗体后加入二抗及底物，在不同的温度及湿度条件下的灵敏度筛选结果如下表1，表1中表示灵敏度的指标是最低检测线，单位ng/ml。表1综合以上指标，最终选择经过上述含有烷基糖苷的亲水试剂处理的玻片作为固相载体。实施例2一种同时定量检测多个牙周病相关蛋白的抗体芯片试剂盒的制备：为了检测样品中是否存在相应的受体，制备固定有20种牙周病相关蛋白对应的特异性抗体的玻片，20种牙周病相关蛋白对应的特异性抗体为普通市售产品。抗体芯片的制备与保存：将100～1000pl的含特异性抗体的pbs缓冲液(含有0.01～10g/100ml牛白蛋白)用全自动点样仪点样于玻片上。具体的芯片点阵以生物素标记的牛igg作为阳性对照。20种抗体及两种不同浓度的阳性对照在每个阵列中都有四个重复点。在本实施例中芯片阵列采用如图1所示的排布方式，但事实上，在其他实施例中，芯片阵列还可以以其它的排布方式进行组合，并不局限于图1所表示的形式。每张玻片上有16个相同的芯片阵列。将点样好的玻片放于室温条件下静置过夜，然后在干燥器中抽气干燥2小时。干燥后的玻片装上配套的16孔框架把一张玻片分割成16个互不干扰的小区。u形框夹从两侧将16孔框架，硅胶垫与标准载玻片卡贴紧在一起，以致标准载玻片贴紧封闭16孔框架的底部，使16孔框架上的每个小格形成一个小的反应孔，16孔框架边缘分别按照孔的位置标注1至16的凹陷数字以方便辨认。用粘性膜封闭框架后，把整张芯片用不透气的小袋封装然后于2℃到8℃保存备用。牙周病相关蛋白标准品的制备：制备牙周病相关蛋白的标准品。将20种牙周病相关蛋白用含0.1％小牛白蛋白的磷酸缓冲液稀释后按照一定的量混合在一起，分装后用冷冻干燥法干燥并于－80℃保存。在本实施例中，用于做标准曲线用的每种牙周病相关蛋白的最终使用浓度如表2所示。表2经梯度稀释后用于作标准曲线的牙周病相关蛋白标准品的浓度(pg/ml)cntrlstd7std6std5std4std3std2std1crp0551654941,4814,44413,33340,000ifnγ014411233701,1113,33310,000il-1α03825742226672,000il-1β03825742226672,000il-20516491484441,3334,000il-403825742226672,000il-603825742226672,000il-801251544133400il-1003825742226672,000il-1203825742226672,000il-17014411233701,1113,33310,000mip-1α014411233701,1113,33310,000mmp-9014411233701,1113,33310,000mmp-13027822477412,2226,66720,000opg0278224774122226,66720,000opn01374121,2353,70411,11133,333100,000osteoactivin014411233701,1113,33310,000rank01374121,2353,70411,11133,333100,000tgfβ101374121,2353,70411,11133,333100,000tnfα03825742226672,000实施例3用本发明的试剂盒定量检测多种牙周病相关蛋白的实验步骤如下：1、玻片芯片的完全干燥：将玻片芯片从盒子中取出来，在室温平衡20～30min后，将包装袋打开，揭开密封条，然后将芯片放在真空干燥器或者室温干燥1～2小时。2、按表2对牙周病相关蛋白进行梯度稀释2.1、添加500μl的样品稀释液到牙周病相关蛋白标准混合物的小管中，重新溶解标准品。打开小管前，先快速的离心，轻轻的上下抽打溶解粉末，标记这个小管为std1。2.2、分别标记6个干净的离心管为std2、std3到std7，添加200μl的样品稀释液到每个小管中。2.3、抽取100μl的std1加入到std2中轻轻混合，然后从std2中抽取100μl加入到std3中，如此梯度稀释至std7。2.4、抽取100μl的样品稀释液到另一个新的离心管中，标记为cntrl，作为阴性对照。注：因为每种牙周病相关蛋白的起始浓度是不同的，所以std1到std7的梯度稀释后，每个牙周病相关蛋白的系列浓度是不同的，本实施例中，梯度牙周病相关蛋白稀释液的浓度如表2所示。3、芯片操作流程3.1、每个孔中加100μl的样品稀释液，室温摇床上孵育30分钟，封闭定量抗体芯片。3.2、抽去每个孔中的缓冲液，添加100μl的标准液和样品到孔中，在摇床上4℃过夜孵育。注：不同样品的孵育量不一样：血浆、血清使用前用样品稀释液1∶1稀释；细胞上清液可用原液；细胞或组织裂解液经蛋白浓度测定后加入5-50ug的量。3.3、清洗：抽去每个孔中的标准品或样品，1×洗液i清洗5次，每次5min室温摇床震荡，每孔150μl的1×洗液i，每次清洗要抽干净洗液，用去离子水稀释20×洗液i。抽去每个孔中的1×洗液i，加入1×洗液ii清洗2次，每次5min室温摇床震荡，每孔150μl的1×洗液ii，每次清洗要抽干净洗液，用去离子水稀释20×洗液ii。3.4检测抗体混合物的孵育：离心检测抗体混合物小管，然后加入1.4ml的样品稀释液，混合均匀后再次快速离心。添加80μl的检测抗体到每个孔中，室温摇床上孵育2小时。3.5清洗：抽去每个孔中的检测抗体，1×洗液i清洗5次，每次5min室温摇床震荡，每孔150μl的1×洗液i，每次清洗要抽干净洗液，然后加入1×洗液ii清洗2次，每次5min室温摇床震荡，每孔150μl的1×洗液ii，每次清洗要抽干净洗液。3.6cy3-链霉亲和素的孵育：离心cy3-链霉亲和素小管，然后加入1.4ml的样品稀释液，混合均匀后再次快速离心。添加80μl的cy3-链霉亲和素到每个孔中，用铝箔纸包住玻片避光孵育，室温摇床上孵育1个小时。3.7清洗：抽去每个孔中的cy3-链霉亲和素，1×洗液i清洗5次，每次5min室温摇床震荡，每孔150μl的1×洗液i，每次清洗要抽干净洗液。3.8荧光检测1)将玻片框架拆掉，小心不要用手接触到玻片印制抗体的一面。2)将玻片放置在玻片清洗管中，添加约30ml的1×洗液i，能整个覆盖住玻片，在室温摇床上震荡15min，弃去1×洗液i，添加约30ml的1×洗液ii，在室温摇床上震荡5min。3)去除玻片的残留洗液。将玻片放置在玻片清洗管/干燥管中，不盖盖子，在1000rpm离心3min。4)采用激光扫描仪例如axongenepix扫描信号，采用cy3或者绿色通道(激发频率＝532nm)。3.9芯片的数据提取以及用分析软件来进行数据分析1)用genepix软件来读取生物芯片的荧光值。2)读数后选用的数值为扣除点周围背景的中间值读数(f532median-localbackground)。用特定的定量芯片软件来作每个牙周病相关蛋白的标准曲线如图2所示。实施例4实验体系交叉反应的测试。抗体芯片实验的准确性在一定程度上受限于所选择的抗原或抗体的来源，纯度与特异性，并且蛋白类抗体的生物与应用存在着抗原性，免疫原性的强弱，异源抗体的类风湿因子和自身抗体的干扰，罕见抗体的高工作量筛选，因些筛选抗体对需要大量的实验验证。抗体对间的交叉反应测试是根据以下方法进行的。不同芯片首先与单个抗原浓度为100ng/ml的不同抗原孵育，洗片后再与每种抗原相对应的检测抗体反应.最后经cy3-链霉亲和素孵育，芯片扫描后读数。以每种抗原的捕获抗体为横轴，以加入的抗原和相对应的检测抗体为纵轴可以得到表3的实验结果。表3.抗体对间的交叉反应测试结果实验结果表明每种抗体对可以特异地识别自己的检测抗原而与其他的抗原没有交叉反应。实施例5实验体系的介质回收率。该定量抗体芯片的在不同样品介质中的适用程度通过测定介质回收率来显示。在2倍稀释的正常人血清和2倍稀释的细胞上清液(cm)中分别加入不同浓度的各个牙周病相关蛋白，用该定量抗体芯片检测，然后计算样品的介质回收率＝(介入样品的牙周病相关蛋白浓度-对照样品的牙周病相关蛋白浓度)/理论上介入的牙周病相关蛋白浓度。实验显示该发明的试剂盒在人血清和细胞上清液中的回收率达31～126％。表4.定量抗体芯片在不同介质中的回收率(pgml)spikingcmcm+agcm％serumserum+agserum％crp20,000014,41172％7,44420,94568％ifnγ5,0003914,42581％273,60772％il-1α1,0002174672％1065464％il-1β1,000063163％051351％il-22,0004322,536105％492,152105％il-41,000141,244123％101,361135％il-61,0001,7262,43671％271,023100％il-81,0001591,156100％695695％il-101,000972672％159059％il-121,00021,198120％285785％il-175,00003,46169％23,25565％mip-1α5,0001107,134140％03,93479％mmp-95,000152,58751％3,3684,06714％mmp-1310,0001299,91998％66,12861％opg10,00034,60239,00944％2312,799128％opn50,00095847,04392％20328,86157％osteoactivin5,000894,99398％2,4934,53841％rank25,0006819,11976％2117,50370％tgfβ150,00031354,434108％060,182120％tnfα1,0004276572％161,301128％综上所述，本发明公开了一种同时定量检测多个牙周病相关蛋白的抗体芯片试剂盒。该试剂盒一方面克服了常规elisa在受体检测中的检测指标单一，耗时，耗力，耗材等缺点，同时也克服了现有多蛋白检测技术中的低通量，重复性差等弱点。该系统使用标准组织玻片作为表面载体，可以在玻片表面完成多重夹心elisa的反应。同时抗体芯片的规格符合标准96孔酶标板的尺寸，使得高通量样品操作成为可能。另外，我们也证实用该发明所检测的受体的浓度可以达到单个elisa的检测灵敏度和精确度。最后，通过对该芯片在不同样品中介质回收率的测定确准该发明的芯片试剂盒可以运用于血清，细胞上清液等不同的生物样品。当前第1页12