组织样本中荧光蛋白荧光信号的保护方法及脱水组合物与流程

本发明属于生物医学和透明标本制备领域，更具体地，涉及一种组织样本中荧光蛋白荧光信号的保护方法及脱水组合物。

背景技术：

完整器官组织透明技术是利用化学或者物理的原理与方法将大块或完整器官透明化处理的技术，透明后的组织样品由于带有荧光蛋白标签，透明后可以直接通过光学仪器对感兴趣的细胞或其他显微结构进行观察研究。组织透明技术避免了传统机械切片的繁琐程序与样品观察的不连续性。

近年来，组织透明方法层出不穷，大体可以分为两类，一类是利用水溶性试剂透明，另一类是利用有机溶剂透明。有机溶剂透明组织是在组织脱水后再进行透明，从透明度上看，此种方法显著优于水溶性试剂透明的组织，因为有机溶剂处理后的组织的透明度非常高，所以很容易使用快速成像设备(如光片照明成像显微镜)进行观察研究。但是，有机溶剂透明处理的标本其内部的荧光蛋白信号淬灭严重，并且只能保存2-3天，不利于样品的稳定观察与长期研究。鉴于越来越多的生物组织在研究时使用荧光蛋白来标记感兴趣的细胞或其他显微结构，所以解决有机溶剂透明组织中的荧光蛋白淬灭问题非常重要。

技术实现要素：

为克服上述现有技术的不足，本发明的目的是提供一种组织样本中荧光蛋白荧光信号的保护方法及脱水组合物，通过这种方法得到的透明组织标本荧光蛋白荧光信号稳定，可在成像设备下长期连续的观察。

为了实现上述目的，作为本发明的一个方面，本发明提供了一种用于生物组织样本最后一步脱水的脱水组合物，包括：

能够使所述生物组织样本脱水的有机试剂；以及

水，其特征在于，水占所述脱水组合物的体积浓度在0.5-3％范围之间。

作为本发明的另一个方面，本发明还提供了一种用于生物组织样本脱水的脱水试剂组合，包括：

N种脱水试剂，所述脱水试剂均包含能够使所述生物组织样本脱水的有机试剂和水，其中，N为大于等于2的整数；

其中，所述N种脱水试剂中用于生物组织样本最后一步脱水的脱水试剂采用如上所述的脱水组合物。

作为本发明的再一个方面，本发明还提供了一种生物组织透明样本中荧光蛋白荧光信号的保护方法，其特征在于，包括以下步骤：

采用如上所述的脱水组合物对待处理的生物组织样本进行最后一步脱水；

进行透明处理，得到所述生物组织透明样本。

基于上述技术方案可知，采用本方法制备的透明组织透明效果好，组织内部荧光蛋白荧光信号不易淬灭，常温下可稳定保存至少3个月以上，透明后的组织标本可用于荧光显微镜、双光子显微镜观察，更重要的是可以利用光片照明成像系统进行快速连续的观察。

附图说明

图1是荧光蛋白转基因小鼠脑标本经本发明实施例1处理后的透明效果图；

图2是荧光蛋白转基因小鼠脑标本经本发明实施例1处理后1天的光片照明显微镜成像图像；

图3是荧光蛋白转基因小鼠脑标本经本发明实施例2处理后3个月的光片照明显微镜成像图像；

图4是荧光蛋白转基因小鼠脑标本经本发明实施例1处理后的荧光蛋白荧光信号照片；

图5是荧光蛋白转基因小鼠脑标本经对比实施例处理后的荧光蛋白荧光信号照片。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，并参照附图，对本发明作进一步的详细说明。

现有以有机溶剂透明组织的方法包含脱水与透明两个过程，其中，组织脱水过程需要经过一系列梯度浓度的脱水剂，并在100％的脱水剂中反复换液，直至确定组织完全脱水后，才将组织浸泡于透明剂中实现透明。但是，按上述操作以有机溶剂透明组织后，组织内部荧光蛋白的荧光信号容易淬灭，无法稳定成像观察。

本发明公开了一种有机溶剂透明组织中荧光蛋白荧光信号的保护方法，是在脱水过程中将最后一步所使用的脱水剂中有机试剂的体积浓度，即脱水剂的最高浓度设为97％-99.5％，使组织内仍然含有微量水分，利用水与有机溶剂产生的轻度乳化效应保护组织内部荧光蛋白的荧光信号。通过该方法制备的组织标本不仅透明度可满足完整器官的成像需要，而且荧光蛋白的荧光信号稳定，可保持至少3个月以上，甚至6个月之久，极大地提高了荧光蛋白荧光信号的稳定性，适合在成像设备下长期连续观察。

更具体地，本发明公开了一种用于生物组织样本最后一步脱水的脱水组合物，包括：

能够使生物组织样本脱水的有机试剂；以及

水，其中水占该脱水组合物的体积浓度在0.5-3％范围之间。

上述方案中，有机试剂例如可以选自乙醇、四氢呋喃、叔丁醇、丙醇、三甘醇、丁辛醇和环己醇中的一种或多种。

本发明还公开了一种用于生物组织样本脱水的脱水试剂组合，包括：

N种脱水试剂，这些脱水试剂均包含能够使生物组织样本脱水的有机试剂和水，其中，N为大于等于2的整数；

其中，该N种脱水试剂中用于生物组织样本最后一步脱水的脱水试剂采用如上所述的脱水组合物。

本发明还公开了一种生物组织透明样本中荧光蛋白荧光信号的保护方法，包括以下步骤：

采用如上所述的脱水组合物对待处理的生物组织样本进行最后一步脱水；

进行透明处理，得到所述生物组织透明样本。

作为优选，在进行最后一步脱水的步骤中，是通过采用如上所述的脱水试剂组合来实现的；

其中，该脱水试剂组合中，有机试剂的体积浓度根据这些脱水试剂的使用先后顺序而逐渐增大。

作为优选，N可以为3、4、5或6，即脱水次数可以为3、4、5或6。

作为优选，进行透明处理的步骤通过使用透明剂浸泡待处理的生物组织样本来实现；其中，透明剂可以选自苯甲酸与苯甲酸苄酯的混合液、苄醚、二苯醚、二甲苯或氯仿。

其中，该生物组织样本可以是部分的，也可以是完整的生物组织样本，优选为完整的样本。

下面结合具体实施例和实验结果对本发明的技术方案作进一步阐述说明。

成年Thy-1小鼠一只，体重约20g，用1ml注射器抽取1％戊巴比妥钠溶液0.2ml，腹腔注射麻醉。

待动物痛觉消失后，开胸充分暴露心脏，快速用装有1×PBS溶液(pH7.4)的注射器自左心室进行心脏穿刺，5分钟内均匀推注1×PBS溶液20ml，动物眼球、前肢及肝脏血色消失，继续灌注4％多聚甲醛溶液20ml(pH7.4，1×PBS配制)。刚开始灌注多聚甲醛时，可见到动物抽动、甩尾，之后动物肢体和尾巴绷直，提示灌注成功。

剪开颅骨，小心分离剪断与脑相连的颅神经，取出完整动物脑标本，浸入4％多聚甲醛溶液中，置于4℃冰箱内继续后固定2小时以上，最好过夜。

实施例1

用蒸馏水配制50％四氢呋喃、70％四氢呋喃、80％四氢呋喃、90％四氢呋喃、97％四氢呋喃各50ml，分别盛放于密封的玻璃瓶内，用铝箔纸将玻璃瓶包裹严实，以避光。将脑标本依次浸泡于由低浓度到高浓度的四氢呋喃脱水剂中内各12小时，再更换新鲜97％四氢呋喃溶液2次，然后再用苄醚作为透明剂对脑标本进行透明处理，将脑标本从97％四氢呋喃溶液中取出后浸入装有50ml苄醚溶液的密封玻璃瓶内2天，同样此玻璃瓶也用铝箔纸进行包裹避光。图1和图2分别是荧光蛋白转基因小鼠脑标本经本发明实施例1处理后的透明效果图和处理后1天的光片照明显微镜成像图像。

实施例2

用蒸馏水配制50％乙醇、70％乙醇、80％乙醇、90％乙醇、98％乙醇各50ml，分别盛放于密封的玻璃瓶内，用铝箔纸将玻璃瓶包裹严实，以避光。将脑标本依次浸泡于由低浓度到高浓度的乙醇脱水剂中内各12小时，再更换新鲜98％乙醇溶液2次。然后再用苄醚作为透明剂对脑标本进行透明处理，将脑标本从97％乙醇溶液中取出后浸入装有50ml苄醚溶液的密封玻璃瓶内1天，同样此玻璃瓶也用铝箔纸进行包裹避光。图3是荧光蛋白转基因小鼠脑标本经本发明实施例2处理后3个月的光片照明显微镜成像图像。

经此方法透明后荧光蛋白荧光信号保留完好，如图4。

对比实施例

用蒸馏水配制50％四氢呋喃、70％四氢呋喃、80％四氢呋喃、90％四氢呋喃、100％四氢呋喃各50ml，分别盛放于密封的玻璃瓶内，用铝箔纸将玻璃瓶包裹严实，以避光。将脑标本依次浸泡于由低浓度到高浓度的四氢呋喃脱水剂中内各12小时，再更换新鲜100％四氢呋喃溶液2次。然后再用苄醚作为透明剂对脑标本进行透明处理，将脑标本从100％四氢呋喃溶液中取出后浸入装有50ml苄醚溶液的密封玻璃瓶内1天，同样此玻璃瓶也用铝箔纸进行包裹避光。

经过此实施例处理后荧光蛋白荧光信号淬灭严重，如图5。

综上所述，本发明有机溶剂透明组织中荧光蛋白荧光信号的保护方法操作简便，透明效果好，透明速度快，更重要的是荧光蛋白荧光信号稳定，可在成像设备下长期连续观察，突出的表现为用于光片照明成像设备进行完整器官快速整体成像。

以上所述的具体实施例，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。